论文部分内容阅读
灰葡萄孢(Botrytis cinerea)既是危害经济作物的重要植物病原真菌,也是研究植物与微生物相互作用的重要模式生物之一,从全基因组水平分析研究该真菌关键基因的功能,可以加速对灰葡萄孢生物学及其致病分子机制的认识,为培育持久抗病品种和制定灰霉病持续管理的策略提供理论依据。农杆菌介导(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)的遗传转化技术,以其特有的优点成为研究真菌与其寄主互作的有力工具。本研究利用ATMT技术,创建了灰葡萄孢突变体,并对部分突变体进行了分析,具体结果如下:(1)为获得灰葡萄孢转化子,对农杆菌介导遗传转化条件进行了优化,确定了筛选转化子最适潮霉素浓度为100μg/mL,头孢噻肟钠与羧卞青霉素对农杆菌有效抑制的浓度均为200μg/mL。确定了共培养最佳方式是灰葡萄孢分生孢子和活化的根癌农杆菌共同涂于玻璃纸上培养,共培养的最佳时间为48 h。应用最适的转化条件,从10~5个分生孢子中平均获得120-150个灰葡萄孢转化子。(2)本试验已得到400多个转化子,通过继代培养初步证明插入到灰葡萄孢基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。对所获得的部分转化子进行PCR及Southern blot验证。根据T-DNA上已知潮霉素基因序列设计引物进行PCR扩增,检测结果发现所检测的转化子均含有目的潮霉素基因片段。随机选取其中6个转化子进行Southern blot验证,结果发现6个转化子均有杂交信号,且其中5个为单拷贝插入。(3)通过TAIL-PCR技术,扩增获得T-DNA插入位点的侧翼序列。对28个有效扩增片段的序列分析结果表明,19个T-DNA边界序列为灰葡萄孢序列,9个为载体主干序列。将定位的17个突变体与野生型菌株进行生物学性状比较,发现获得的部分突变体在菌株颜色、菌核的有无、分生孢子形态及产孢量方面发生明显变化。致病性测定结果表明,有1个突变体完全丧失致病能力。本文利用农杆菌转化方法成功地将T-DNA插入灰葡萄孢基因组,获得了一批基因被标签的突变体,并发现了若干关键性状对应的基因,是灰葡萄孢功能基因组学的良好开端,具有重要的科学意义和应用前景。