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目的:胃癌的分子靶向治疗近年来备受关注。人表皮生长因子受体2（HER2）阳性胃癌的靶向治疗也已取得了一些进展。然而,抗HER2治疗的耐药问题严重限制了其疗效。吡咯替尼是一种新型的不可逆的泛HER酪氨酸激酶抑制剂。阿帕替尼是一种抗血管的小分子抑制剂。尽管这两种药物均已被单独用于胃癌的治疗,然而在HER2阳性胃癌中联合应用吡咯替尼和阿帕替尼尚未见报道。本研究将利用HER2阳性胃癌的体内外模型来评估吡咯替尼联合阿帕替尼在HER2阳性胃癌中的作用。方法:本研究采用western blot和qRT-PCR法检测了五种胃癌细胞株NCI-N87、SNU216、SGC7901、MGC-803和MKN45中HER2的表达情况,并采用CCK-8法分别检测了吡咯替尼和阿帕替尼对上述细胞的抑制作用以及计算相应药物的半抑制浓度（IC50）。选择HER2高表达的NCI-N87和SNU216细胞作为后续实验对象。分别用吡咯替尼、阿帕替尼以及两药联合预处理NCI-N87和SNU216细胞,CCK-8法和克隆形成实验检测药物对细胞增殖的抑制作用;Transwell实验检测药物对细胞侵袭性的影响;流式细胞术检测药物对细胞凋亡的影响;western blot检测药物处理后EGFR/HER2下游通路的变化及凋亡相关蛋白的表达情况。应用NCI-N87和SNU216裸鼠移植瘤模型验证两药联用的效果,并通过体内动物模型探索了吡咯替尼和阿帕替尼之间的相互作用关系。结果:相对于吡咯替尼或阿帕替尼单药,两药联合显著增强了对HER2阳性胃癌细胞的存活、增殖和侵袭的抑制作用,以及对细胞凋亡的促进作用。吡咯替尼与阿帕替尼在NCI-N87体内移植瘤模型中发挥协同作用,联合指数小于1,且二者联合应用对NCI-N87和SNU216移植瘤的生长抑制作用较单药治疗更明显（P<0.05和P<0.01）。联合应用吡咯替尼和阿帕替尼增强了对PI3K/AKT和MAPK信号通路的抑制且上调了凋亡相关蛋白的表达。结论:在HER2阳性胃癌中联合应用吡咯替尼和阿帕替尼可显著增强抗肿瘤效果。目的:分子靶向药物的耐药问题是其应用于临床的常见局限性之一。目前已有研究报道了经典的抗HER2药物曲妥珠单抗及其他靶向HER2的小分子抑制剂在HER2阳性胃癌中的耐药性和相关机制。吡咯替尼目前已应用于包括HER2阳性胃癌在内的多种实体瘤中,但尚未发现关于其获得性耐药机制的相关研究。本部分研究旨在明确获得性吡咯替尼耐药的发生,并探索其潜在机制。方法:以吡咯替尼敏感的HER2阳性胃癌细胞株NCI-N87为亲本,构建获得性吡咯替尼耐药的胃癌细胞株NCI-N87-AR。采用CCK-8法和克隆形成实验检测吡咯替尼对细胞增殖的抑制作用并计算IC50。利用RNA测序的方法对比亲本NCI-N87细胞和耐药NCI-N87-AR细胞之间的差异,筛选与获得性吡咯替尼耐药相关的基因及通路。采用western blot和qRT-PCR法验证上述基因及通路。利用外源性干细胞因子（SCF）刺激NCI-N87和NCI-N87-AR细胞,CCK-8法和克隆形成实验验证其在吡咯替尼耐药中的作用。采用western blot检测SCF下游相关通路的变化情况。结果:NCI-N87和NCI-N87-AR细胞对吡咯替尼的敏感性具有显著差异（P<0.01）,二者中吡咯替尼的IC50分别为0.04±0.01μM和4.15±0.28μM。采用吡咯替尼预处理后,NCI-N87-AR细胞的增殖能力明显强于NCI-N87细胞（P<0.001）,说明前者对吡咯替尼耐药。对比分析两种细胞的RNA测序结果发现,KITLG和PIK3R1上调以及PI3K/AKT和MAPK通路与获得性吡咯替尼耐药的发生相关,且被western blot和qRTPCR所验证。SCF通过c-kit介导的PI3K/AKT和MAPK通路的激活,促进了NCIN87和NCI-N87-AR细胞的存活和增殖。结论:SCF上调可能通过c-kit介导的PI3K/AKT和MAPK通路的激活,导致了HER2阳性胃癌中获得性吡咯替尼耐药的发生。目的:在前一部分研究中我们发现,SCF可能通过c-kit介导的PI3K/AKT和MAPK通路的激活导致HER2阳性胃癌中获得性吡咯替尼耐药的发生。通过抑制c-kit受体阻断替代性通路的激活,可能是解决HER2阳性胃癌中获得性吡咯替尼耐药的潜在方法。阿帕替尼除了选择性靶向VEGFR2外,它还可有效抑制c-kit受体的激活。有研究表明HER2阳性胃癌患者在曲妥珠单抗治疗失败后可能从阿帕替尼治疗中获益,然而阿帕替尼在吡咯替尼耐药中的作用尚未见报道。本部分研究主要探讨阿帕替尼在获得性吡咯替尼耐药中的作用及相关机制。方法:采用western blot检测不同浓度的阿帕替尼对SCF/c-kit及下游通路的影响。分别用吡咯替尼、阿帕替尼以及两药联合预处理NCI-N87-AR细胞,CCK-8法和克隆形成实验检测药物对细胞增殖的抑制作用;Transwell实验检测药物对细胞侵袭性的影响;流式细胞术检测药物对细胞凋亡的影响;western blot检测药物处理后NCI-N87-AR细胞中SCF/c-kit下游通路的变化及凋亡相关蛋白的表达情况。应用NCI-N87-AR裸鼠移植瘤模型验证两药联用的效果。结果:阿帕替尼对c-kit磷酸化以及下游PI3K/AKT和MAPK通路的抑制作用随其浓度的增加而增强。SCF促进了NCI-N87细胞中PI3K/AKT和MAPK通路的激活,而阿帕替尼抑制了NCI-N87-AR细胞中c-kit介导的PI3K/AKT和MAPK通路的激活。相对于吡咯替尼或阿帕替尼单药,两药联合显著增强了对NCI-N87-AR细胞的存活、增殖和侵袭的抑制作用以及对细胞凋亡的促进作用。吡咯替尼联合阿帕替尼在NCIN87-AR移植瘤中的生长抑制作用显著强于二者中任一单药治疗（P<0.05和P<0.01）。联合应用吡咯替尼和阿帕替尼增强了对PI3K/AKT和MAPK信号通路的抑制且上调了凋亡相关蛋白的表达。结论:阿帕替尼可通过靶向c-kit抑制SCF/c-kit及下游PI3K/AKT和MAPK通路的激活,进而逆转获得性吡咯替尼耐药。在吡咯替尼耐药的HER2阳性胃癌中联合应用吡咯替尼和阿帕替尼可显著增强抗肿瘤效果。