【研究背景及目的】终末期肝病的治疗一般为肝脏器官移植,然而目前存在供肝不足、或者患者等不到肝源而死亡等现象。肝细胞移植是一种替代治疗方法,是指将肝细胞通过各种手段移植入病人体中,代替受损肝脏发挥作用。肝细胞移植术发展很早,距今已有30多年的历史,然而目前存在移植细胞体内增殖困难等问题导致其发展不前。我们在研究肝再生模型当中发现,肝细胞体内实现再生的过程实际上是由肝细胞与周围环境共同作用的结果。在肝再生领域,由于其面临的瓶颈在于原代肝细胞来源的缺乏以及不能在体外实现大规模增殖,大部分的研究者将重心放在实现治疗细胞的体外扩增和肝功能的表达上,研究方法包括将体内各类细胞在体外经定向分化转变为功能肝细胞,如体细胞诱导多能干细胞(i PSC),胚胎干细胞(ESC),间充质干细胞(MSC)等等,以及转录因子诱导成纤维细胞转分化为肝细胞。这些细胞通过特定基因的过表达和培养刺激可实现体外大规模的扩增,同时经过定向分化在体外具备一定的肝功能,但是总的来说,这些细胞在体外的肝功能表达并不是十分完善和稳定,体内的重建效率也非常低,不能达到治疗的目的。另外经过病毒感染和基因重组的细胞应用于临床也存在很高的安全风险。因此我们一直尝试采用小分子化合物来诱导原代肝细胞的转分化,经过长时间探究和筛选,最终我们确定一系列小分子化合物的组合形式,成功实现了小鼠原代肝细胞在体外的持续增殖。增殖的细胞命名为hep PDCS,具备肝祖细胞的特性,而在小分子化合物的诱导下,又可以停止增殖重新分化为有典型肝功能的肝细胞hep PDCS-hep。相较于其他方法诱导来源的功能肝细胞,这类细胞没有经过病毒感染,基因组未插入任何片段,确保了肝细胞移植的安全性。除此之外,最具意义的是,hep PDCS-hep进行移植后最高的替代率可达到70%以上,具有良好的医疗运用前景。与此同时,我们还探究了肝脏损伤微环境对肝细胞移植的影响。肝脏微环境主要由肝脏中的巨噬细胞(Kupffer cells)、窦状内皮细胞、星状细胞等非实质细胞及其分泌的各类细胞基质和细胞因子构成。其中Kupffer细胞数量占肝细胞总体数量的15%,具备非常多的生物学功能:抗原提呈;吞噬作用;参与肝脏代谢;参与肿瘤的发生发展及促进肝再生等。激活后的Kupffer细胞分泌大量细胞因子:TNF、TGF-B、IL-1、IL-6等等,其中TNF-A和IL-6启动了肝脏的再生以及肝干细胞的活化和增殖过程,使肝细胞由G0期到G1期并通过限制点进入S期,完成有丝分裂。后续的研究中发现Kupffer细胞分泌的IL-17也可以启动肝脏再生。有研究人员在肝切的模型中证明清除Kupffer细胞后会延迟肝再生的过程,也有人证明清除Kupffer细胞后加速肝再生的过程。然而没有研究深入探讨Kupffer细胞是否对肝细胞移植有所影响。我们通过实验发现,巨噬细胞可影响Fah再生模型中细胞定植和增殖的过程。综上所述,本研究通过获得在体内外兼具备良好功能的肝细胞以及研究肝再生过程中肝脏微环境的变化,找到了可能提高移植效率的方法,从而为临床的移植细胞来源与方式提供新的策略和参考。【实验方法】1.小分子化合物的筛选及组合通过CK19-Cre ERT/R26GFP小鼠的基因报告系统来确定。2.采用免疫荧光,流式细胞术,芯片分析,PCR等检测手段验证肝细胞体外的胆管化增殖;通过细胞计数,倍增时间,核型分析等方法确定肝细胞能否在体外进行基因型稳定的大规模扩增。3.为了进一步验证体外增殖的细胞无体内胆管化细胞以及其他非实质细胞的污染,将R26YFP小鼠经尾静脉注射AAV8-TBG-Cre病毒,1周以后分离原代肝细胞进行流式分选,分选自带GFP荧光的肝细胞后进行贴壁培养。4.将肝细胞进行肝系和胆系的定向分化后,通过免疫荧光,芯片分析,罗丹宁,药物代谢,El ISA等实验确定体外增殖的肝细胞是否具有双向分化的潜能。5.将肝系分化的成熟肝细胞移植入Fah基因缺陷的小鼠体内,在2个月后通过免疫组化,生化检测验证其移植的效率以及对小鼠肝功能,生存率的影响。6.将维持Fah基因缺陷小鼠生存的药物NTBC撤除后,通过免疫组化在不同的时间点观察巨噬细胞的变化。7.采用脂质体将Fah基因缺陷小鼠体内的巨噬细胞清除后,移植原代肝细胞,比较在不同时间点肝细胞重建肝脏的比例。8.分离Fah基因缺陷小鼠骨髓单核细胞,采用GM-CSF细胞因子刺激单核细胞转变为巨噬细胞,经培养与鉴定后,将纯化的巨噬细胞与原代肝细胞按一定比例混合回输入撤药后的Fah基因缺陷小鼠肝脏内,观察在此条件下肝细胞重建的效率是否受到影响.【实验结果】1、在特定培养条件刺激下,肝细胞可以进行长时间的胆管化增殖。2、通过CK19-Cre ERT/R26GFP小鼠与注射AAV8-TBG-Cre病毒的R26YFP小鼠证明成熟肝细胞可以在体外胆管化增殖。3、hep PDCS具有肝前体细胞的特征:经过肝系分化的肝细胞具有成熟肝细胞的特性,表达肝特异性基因,具有分泌白蛋白,药物代谢,尿素合成,存储糖原等功能;在三维培养中可形成具有功能的胆小管结构。4、分化成熟的肝细胞回输入Fah基因缺陷小鼠肝脏后,能缓解肝损伤,显著提高小鼠生存率,最高的整合效率可达90%以上。5、Fah基因缺陷小鼠在NTBC撤除后,随之时间的延长伴随着巨噬细胞的活化。6、清除巨噬细胞后有利于提高肝细胞移植的重建效率。7、巨噬细胞与肝细胞共同移植回输入Fah基因缺陷小鼠的体内后,小鼠的肝损伤加重,肝脏重建效率降低。【结论】本研究通过小分子化合物的诱导,成功地实现了原代肝细胞在体外的胆管化增殖。这种形式增殖的细胞没有经过病毒感染,基因组未插入任何片段,确保了肝细胞移植的安全性。此外,细胞在定向分化后具有成熟肝细胞的功能,并且可以大面积地整合到Fah基因缺陷小鼠的体内,提高小鼠的生存率,为临床肝细胞移植提供新型的细胞来源;同时,在Fah基因缺陷小鼠的模型中,我们还发现肝损伤的过程中伴随着巨噬细胞的活化,清除巨噬细胞后肝细胞移植的效率提高,这提示我们,移植的肝细胞在体内能够增殖不仅取决于细胞本身的功能,肝脏微环境对于移植细胞的整合也是一个很重要的影响因素。