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胃癌是危害人类生命的常见的恶性肿瘤，化疗是肿瘤综合治疗的重要手段之一。而多药耐药性是影响临床化疗的主要难题，目前的已知耐药机制不能充分解释肿瘤的MDR现象。进一步阐明其发生机制是解决MDR的基础。为了深入了解MDR的分子机制的复杂性，本研究所应用消减杂交和差异显示PCR技术，获得了在胃癌多药耐药细胞系SGC7901／VCR和SGC7901／ADR中高表达，而在药敏细胞SGC7901中低表达的若干胃癌耐药相关基因。胃癌细胞诱导耐药后，在形态学和基因水平发生相当大的改变，甚至包括一些质的改变。本实验首先从形态学对胃癌耐药细胞表型特征进行观察和分析，从中寻找在胃癌耐药性形成过程中普遍存在的规律。以胃癌耐药细胞表型特征的规律及已经被阐明的耐药性形成规律为依据，从上述若干胃癌耐药相关基因选取了6个基因。进行基因克隆和功能鉴定，拟从中进一步筛选出可能在胃癌多药耐药性形成机制中起关键作用的分子。 目的：首先应用透射电子显微镜，共聚焦显微镜技术检测胃癌耐药细胞形态学的变化；通过流式细胞仪技术检测化疗药物对亲本敏感胃癌 第四军医大学博士学位论文一细胞和耐药细胞的细胞周期的影响．并根据所观察到的形态学特征，从63个彼差异显示出的耐药相关基因中选出6个基因，分别为NPD017、hC－l、ME3、MRSZL、TBPIP和MADZ。克隆鉴定该六个耐药相关基困，并进行基因的功能学分析，以探讨耐药相关基因可能的耐药作用机制． 方法：门）．应用透射电子显微镜，共聚焦显微镜枝术检测胃癌耐药细胞形态学的变化；通过流式细胞仪技术检测化疗药物对亲本敏感胃癌细胞和耐药细胞细胞周期的影响。刁．借助 RT－PCR、DNA测序和基因克隆技术获得上述六个基困的全长。DNA编码序列，并亚克隆至真核正反义表达载体。O）．应用基固转染、RNA打点杂交、Northern blot、Western blot、药敏实验和流式细胞仪技术检测六个耐药相关基因的表达对化疗药物的敏感性和药物外排的影响及作用。 结呆：口）．共聚焦显微镜观察到无论是阿霉素smgL－‘作用lh，还是阿霉素 ling·L’作用 24h，耐药细胞（SGC7901／VCR和SGC7901／ADR）核内阿霉素蓄积浓度都明显低于胞浆内浓度。而亲本敏感细胞核内药物蓄积浓度很高甚至大于胞浆。导致耐药细胞内的平均药物蓄积浓度远远低于亲本敏感细胞。耐药细胞间拔丝样连接结构增多，细胞核形状不规则，而敏感细胞核膜被荧光药物深染，核多为椭圆形，几乎不见分裂相。出．耐药细胞阿霉素高浓度蓄积在核膜一侧或呈点状分布于胞浆，具有内膜系统包括高尔基体和内体等的分布特征。提示核浆转运和胞外分泌途径参与了胃癌细胞多药耐药性的形成；③．耐药和敏感细胞间接触均有典型的桥粒样结构，均有细胞内小管样结构和影液湖。但耐药细胞的粘液湖明显增多．细胞膜间虽未观察到典型的紧密连接的结构，但却有类似的结构。耐药细胞核膜明显地不规则、深陷甚至卷曲。耐药细胞体积增大，细胞膜表面绒毛变长变多，细胞膜之间 3 第四军医大学博士学位论文一突触样的联系增多，并能形成细胞间小管结构，细胞膜有部分的融合现象。提示核浆转运和胞外分泌途径参与了胃癌细胞多药耐药性的形成。N）．阿霉素能将亲本细胞 SGC790阻滞在 GZ／M期，而耐药细胞不被阻滞在 GZ／M期。能够进入下一个细胞周期，细胞周期分布基本上无变化。这提示耐药细胞能够克服化疗药物引起的细胞周期阻滞，涉及细胞周期调节的分子参与了胃癌细胞耐药性的形成。（5）．获得TBPIP、NPD017、TTC－l、ME3、MRSZL、MADZ和 MADZp 的基因全长CDNA编码序列，将其正义转染亲本敏感胃癌细胞系 SGC790，发现TBPIP、NPDOI7、TTC－l、MADZ D 和 MRSZL能增强亲本敏感细胞系SGC7901对化疗药物阿霉素的泵出作用，6 ME3降低了亲本敏感细胞系 SGC7901化疗药物阿霉素的泵出作用。体外药敏实验提示 ME3、NPD017和MADZ 6 在SGC7901 细胞的表达上调，能显著增强SGC7901细j包对VCR的耐受性；ME3、TTC－1、TBPIP和MAI）Zp在SGC790 细胞的表达上调，能显著增强细胞对 ADR的耐受性；降低ME3在 SGC7901／VCR细胞的表达，能显著增强 SGC7901／VCR细胞对MMC、ADR、VCR的敏感性。（6〕在扩增MADZ 基困编码序列时，得到MADZ基困的一个选择性剪接体，该形式未见文献报道，缺失了MADZ的一个外显子。将其命名为MADZ p。（7．重组正义表达载体pcDNA3．1／MADZ p丰染SGC7901细胞，G418筛选2个月后，Westernhi成鉴定为转染细胞株。MTh法证实，SGC7901／MADZ fi 对化疗药物ADR． VCR和 MMC的耐药性增强。与 SGC7901／pCDNA3 ＊比较，无论阿霉素大剂量短期冲击，还是中等剂量持续作用，sGC79m／MAD二p细胞内的平均荧光强度均比对照组 SGC7901／pCDNA3＊低。 4