论文部分内容阅读
研究背景动静脉内瘘（Arteriovenous Fistula,AVF）通畅是血液透析患者顺利进行透析的必备条件,而内膜增生狭窄导致的血管通路功能障碍是患者死亡率增加的重要因素,目前临床上缺乏有效的防治手段。因此,如何防治AVF内膜增生狭窄并提高通畅率是近年来血液净化领域的热点及难点。在基础研究领域,有关AVF内膜增生机制的研究日益增多,但尚未有防治AVF狭窄的科学、有效的手段。究其原因在于缺乏特异性靶点、针对性的干预药物和有限的临床用药方式等。血管平滑肌细胞表型转换及迁移是动静脉内瘘新生内膜的重要病理基础,但具体机制未明。近年来生物力学研究证实,VSMCs细胞膜上的力学感受器能将机械力信号转导为生物化学信号,从而发挥调控VSMCs表型转换、影响血管稳态的作用。在众多的力学感受器中,Hippo-YAP信号通路受到广泛关注,Hippo-YAP信号通路可调控VSMCs增殖和迁移等功能,参与到血管损伤及重塑过程之中。基于此,不难推测Hippo-YAP信号参与了AVF内膜增生,临床用药维替泊芬（VER）作为YAP抑制剂用于改善AVF内膜增生极具潜力。此外,传统的血管治疗措施存在药物体内生物利用度低和不优先影响病变细胞等短板,造成药物在靶点部位富集较少且容易出现不必要的全身副作用,而纳米载体技术的发展为血管损伤性疾病的治疗提供新的解决策略,故开发创新性血管外用药及纳米材料载体体系的开发具有临床前景。研究目的1.探讨慢性肾脏病小鼠动静脉内瘘血管平滑肌细胞YAP信号是否参与内膜增生的过程;2.设计与合成活性氧敏感的高分子材料,构建负载维替泊芬（VER）的纳米颗粒/水凝胶体系;3.在细胞水平上探讨远程调控纳米颗粒/水凝胶体系释放的VER对VSMCs增殖迁移的影响,系统研究该体系在细胞水平上的生物学机制;4.在动物水平上论证纳米颗粒/水凝胶体系在体内转运的稳定性及安全性,探讨该体系及控释药物递送策略在临床应用中的潜在价值。研究方法一、动静脉内瘘新生内膜中YAP表达及在血管平滑肌细胞增殖中的作用1建立慢性肾脏病小鼠颈总动脉-颈外静脉的端侧吻合AVF模型,收集AVF及正常小鼠血管组织,通过HE及免疫组织化学染色,评估AVF新生内膜及YAP、SMA-α在AVF内膜中的表达;2通过划痕实验验证YAP抑制剂VER能够抑制VSMCs的迁移;构建过表达YAP的VSMCs细胞模型,Western Blot检测VER对VSMCs中YAP、SMA-α、PCNA、CTGF蛋白表达的影响;二、负载维替泊芬的纳米颗粒/水凝胶体系的构建与表征1.合成ROS敏感的超支化聚磷酸酯材料TK-hb PPE,并通过~1H NMR表征制备的载体材料;利用单乳化法实现TK-hb PPE包载VER为载药纳米颗粒TKhb PPE/VER,并将其与PLGA-PEG-PLGA温敏性水凝胶（PPP）共混,构建纳米颗粒/水凝胶体系TKhb PPE/VER@PPP;2.表征该载药纳米颗粒/水凝胶体系:（1）采用动态光散射仪及透射电子显微镜检测纳米颗粒TKhb PPE/VER的尺寸及形貌;（2）使用紫外分光光度计和荧光分光光度计测定TKhb PPE/VER@PPP体系中VER含量,计算包封率;（3）通过SOSG检测试剂盒检测不同光照条件下TKhb PPE/VER产生ROS情况,并对比不同光照条件下的药物释放行为;三、TKhb PPE/VER@PPP体系对血管平滑肌细胞YAP蛋白表达的影响1.细胞摄取实验:纳米颗粒水凝胶混合液快速加到Transwell上室中,先置于空24孔板,放置培养箱中待其成胶,通过660 nm红光照射Transwell上室,之后将上室转移到含有细胞的孔板中继续培养4 h,流式细胞术检测VSMCs中的VER含量,激光共聚焦术观察VER在细胞内的定位情况;2.细胞毒性实验及凋亡实验:CCK 8法测定红光激发下释放的VER对VSMCs细胞活力的影响;Annexin V-FITC/PI及死活染色检测VSMCs细胞的凋亡;3.通过划痕实验验证载药纳米颗粒水凝胶体系中VER释放对VSMCs的迁移抑制作用;构建过表达YAP的VSMCs细胞模型,Western Blot检测红光调控下释放的VER对VSMCs增殖（YAP、SMA-α、PCNA、CTGF）的影响;4.利用660 nm红光0.05 W/cm2照射VSMCs 5 min,CCK 8法测定细胞活力,Western Blot检测红光照射对VSMCs中的YAP、SMA-α、PCNA、CTGF蛋白表达的影响,探究小功率照射对细胞的安全性行为;四、TKhb PPE/VER@PPP体系在小鼠体内的初步探索1.TKhb PPE/VER@PPP体系在小鼠血管组织中的富集及含量:在血管局部植入纳米颗粒/水凝胶TKhb PPE/VER@PPP,待凝固成胶后缝合皮肤。（1）小动物成像技术检测纳米药物颗粒在组织中富集;（2）红光照射后不同时间点（4、8、12、24、48、72 h）取材,检测颈外静脉组织标本中VER含量;2.TKhb PPE/VER@PPP体系对小鼠的安全性评价:在小鼠正常颈总动脉涂抹TKhb PPE/VER@PPP,并给予0.05 W/cm2红光照射5 min,1周后检测小鼠血液肝肾功能,探讨该体系短期内对小鼠的安全性。研究结果一、动静脉内瘘新生内膜中YAP高表达及参与血管平滑肌细胞迁移及增殖1.慢性肾脏病小鼠在AVF术后4周出现内瘘内膜组织增厚及管腔狭窄,内膜组织存在YAP高表达;2.YAP抑制剂VER显著抑制血管平滑肌细胞中YAP、SMA-α、CTGF蛋白的表达,并且能够抑制细胞的迁移功能。二、成功构建负载维替泊芬的纳米颗粒/水凝胶体系TKhb PPE/VER@PPP1.核磁共振氢谱证明ROS敏感的聚磷酸酯材料TK-hb PPE成功合成,负载VER制备成载药纳米颗粒TKhb PPE/VER,将PLGA-PEG-PLGA温敏性水凝胶与TKhb PPE/VER以不同质量比在常温下进行混合,发现在15:1质量比的比例下形成稳定的TKhb PPE/VER@PPP体系;2.动态光散射及透射电子显微镜检测纳米颗粒TKhb PPE/VER的粒径均一,尺寸为300nm,紫外可见光吸收谱发现纳米颗粒与游离维替泊芬（VER）均在波长660 nm处有吸收峰,证实该纳米颗粒成功负载VER,包封率为30-35%。SOSG探针发现随着光照时间的延长,TKhb PPE/VER产生的ROS逐渐增多。使用660 nm红光以0.05W/cm2的光强照射载药纳米颗粒5 min,发现负载的VER药物能够缓慢释放,在24h后药物累积释放量达到总药量的18%。三、TKhb PPE/VER@PPP体系阻断YAP信号对VSMCs增殖的影响1.光照该体系后,激光共聚焦观察VER定位在VSMCs的细胞核周及核内,并且通过流式细胞仪检测发现VSMCs可以摄取到更多的VER;2.CCK 8及死活染色结果显示,不同VER浓度下红光照射TKhb PPE/VER@PPP,对VSMCs细胞活力及增殖显示出较强的抑制效果,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡染色发现经过红光照射后,TKhb PPE/VER@PPP光照组的早期及晚期凋亡细胞较多,而非光照组与正常对照组基本上不引起细胞凋亡,统计学上具有明显的差异（P<0.001）,这说明红光照射该体系,促使VER释放进入VSMCs,抑制细胞增殖及诱导凋亡;3.细胞划痕实验结果显示,红光照射TKhb PPE/VER@PPP体系后VSMCs划痕距离显著缩小,表明该体系释放的VER能够显著抑制VSMCs的迁移能力。同时,Western Blot发现TKhb PPE/VER@PPP在光照后显著降低过表达YAP基因的VSMCs中的YAP、SMA-α、PCNA及CTGF蛋白表达;4.较小的光强及较短的时间（0.05 W/cm2、5 min）照射细胞,CCK 8检测细胞活力状态的影响统计学上没有差异,同时,在蛋白水平上检测增殖相关蛋白表达无差异,结果表明小功率红光照射对细胞具有较好的安全性。四、载药纳米颗粒/水凝胶TKhb PPE/VER@PPP体系在小鼠血管上的应用1.小动物活体成像结果发现载药纳米颗粒水凝胶能够在小鼠左侧颈部局部聚集,于不同时间点留取颈外静脉组织检测组织中VER药物含量,实验结果发现表明,照射后4 h,静脉组织萃取液中即可检测到VER,随着时间延长组织内VER含量逐步升高,在24 h达到高峰,并持续至72 h仍能检测到少量的VER;2.在小鼠正常血管涂抹TKhb PPE/VER@PPP并给予红光照射,小鼠血液指标发现光照组与非光照组相比肝肾功能无统计学差异,这说明该体系在较小剂量下短期内对小鼠具备良好的安全性。研究结论:1慢性肾脏病小鼠动静脉内瘘新生内膜中存在YAP蛋白高表达,YAP参与血管平滑肌细胞的增殖及迁移过程;2成功制备及表征载药纳米颗粒TKhb PPE/VER,构建载药纳米颗粒/水凝胶体系TKhb PPE/VER@PPP;3该体系在红光照射下触发载药纳米水凝胶体系TKhb PPE/VER@PPP,释放VER,抑制血管平滑肌细胞增殖及迁移,并下调细胞内YAP蛋白的表达;4该凝胶载药体系能够在血管周围滞留,在光控调节下释放VER,并且体内使用安全,这提示,TKhb PPE/VER@PPP体系血管外周给药具备一定可行性,远程光控给药能够促使纳米颗粒崩解释放药物,为血管局部给药干预AVF内瘘狭窄提供可行方案。