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1.临床研究目的观察醒脾解郁方对肝郁脾虚抑郁症患者肠道菌群、肠粘膜通透性及血清炎性因子的影响,初步揭示醒脾解郁方的效应机制。方法纳入肝郁脾虚抑郁症患者及健康志愿者,肝郁脾虚抑郁症患者予中药醒脾解郁方颗粒剂,疗程6周,治疗过程中进行安全性检测,治疗前后进行汉密尔顿抑郁量表(HAMD-17)、患者健康问卷躯体症状群量表(PHQ-15)测评。肝郁脾虚抑郁症患者治疗前后及健康志愿者均采集血液及粪便,采用16SrRNA高通量测序检测粪便肠道菌群,采用酶联免疫吸附法(Elisa)检测血清肠粘膜屏障功能指标及炎性细胞因子,包括:脂多糖(LPS)、D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。结果(1)疗效量表评分:与治疗前相比,肝郁脾虚抑郁症组治疗后HAMD-17评分与PHQ-15评分均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。(2)肠道菌群测序结果:①α多样性:健康对照组与肝郁脾虚抑郁症组之间以及肝郁脾虚抑郁症组治疗前后相比,Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数、ACE指数均没有统计学差异(P>0.05)。②β多样性:PCoA及NMDS图示肝郁脾虚抑郁症组(治疗前)与健康对照组样本分别聚类,样本的微生物组成存在差异,肝郁脾虚抑郁症组治疗前后样本存在交叠,治疗后样本聚类更为明显。③物种组成分析:组间进行T检验得出,与健康对照组相比,肝郁脾虚抑郁症组Verrucomicrobia、Clostridia、Verrucomicrobiae、Clostridiales、Verrucomicrobiales、Akkermansiaceae、Faecalibacterium、phascolarctobacterium、Akkermansia 相对丰度减少(P<0.05),Corynebacteriales、Nocardiaceae、Roseburia、Butyricicoccus、Rhodococcus、Turicibacter 相对丰度增加(P<0.05)。与治疗前相比,肝郁脾虚抑郁症组治疗后Negativicutes、Coriobacteriia、Selenomonadales、Coriobacteriales、veillionellaceae、Coriobacteriaceae、Clostridiales、Dialister、Collinsella、Clostridiales中未鉴定的菌群、Turicibacter中未鉴定菌群相对丰度减少(P<0.05),Corynebacteriales相对丰度增加(P<0.05)。④LefSe分析得出健康对照组富集 Clostridia、Clostridiales、Faecalibacterium、Blautia、Bacteroides stercoris;肝郁脾虚抑郁症组富集Actinobacteria、Ruminococcus。治疗前后相比,治疗前最优势菌群为 Selenomonadales 纲,Negativicutes目,Veillonellaceae 科。(3)血清LPS、D-乳酸及DAO水平变化:与健康对照组相比,肝郁脾虚抑郁症组(治疗前)血清LPS、D-乳酸、DAO水平均显著升高(P<0.01);与治疗前相比,肝郁脾虚抑郁症组治疗后血清LPS、D-乳酸、DAO水平均显著降低(P<0.01)。(4)血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α水平变化:与健康对照组相比,肝郁脾虚抑郁症组(治疗前)血清IL-6、TNF-α水平均显著升高(P<0.01);与治疗前相比,肝郁脾虚抑郁症组治疗后血清IL-6、TNF-α水平均显著降低(P<0.01)。结论肝郁脾虚抑郁症患者存在肠道菌群紊乱,肠粘膜通透性改变及外周血炎性因子的增高,醒脾解郁方可通过降低致病菌相对丰度、改善肠粘膜通透性、减轻外周炎症反应发挥其抗抑郁作用。2.实验研究目的进一步验证醒脾解郁方对肝郁脾虚抑郁症肠道微生态的调节作用,并通过对肠道、大脑TLR4/NF-κB通路关键蛋白的检测,深入探讨醒脾解郁方对肠道微生态失衡介导的炎症反应的具体调节机制,同时加入西药阳性药对照,揭示中西药的不同效应机制。方法将8周龄SPF级雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、中药组、西药组,空白对照组与模型组各7只,中药组、西药组各8只。采用慢性束缚的方法复制肝郁脾虚抑郁大鼠模型,造模同时灌胃给药,连续应激21天时进行模型评价,采集粪便样本,分离结肠组织、脑组织。采用16SrRNA高通量测序检测粪便肠道菌群,采用Western blot及Q-PCR检测结肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin蛋白及mRNA表达,以及结肠、前额叶皮层TLR4、NF-κ B蛋白及mRNA表达,Elisa检测结肠、前额叶皮层LPS、IL-6、TNF-α 表达。结果(1)模型评价:造模后期,模型组大鼠体重增长明显缓慢,精神倦怠,喜扎堆或蜷缩,对束缚无明显抵抗,毛发干枯发黄;糖水偏好率较空白对照组明显下降(P<0.01),强迫游泳不动时间较空白对照组明显延长(P<0.01),此外通过醒脾解郁方反证,表明肝郁脾虚抑郁大鼠造模成功。(2)肠道菌群测序结果:①α多样性分析:各组大鼠Shannon指数、Simpson指数无明显差异(P>0.05)。与空白对照组相比,模型组大鼠Chao1指数与ACE指数均明显下降(P<0.01);与模型组相比,中药组大鼠Chao1指数与ACE指数均显著升高(P<0.01),西药组有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);与西药组相比,中药组大鼠Chao1指数与ACE指数均显著升高(P<0.01)。②β多样性分析:PCoA及NMDS图示空白对照组与模型组微生物组成存在显著差异,中药组与空白对照组菌群结构相似,西药组菌群结构与模型组更为相近。③物种组成分析:各组均以Firmicutes、Bacteroidetes为绝对优势菌,但比例不同,在各分类水平上均存在差异菌属。④物种差异分析:模型组与空白对照组的差异菌群主要为Proteobacteria、Chloroflexi、Deltaproteobacteria、Desulfovibrionales、Lachnospiraceae、Desulfovibrionaceae、Gammaproteobacteria、Roseburia、Oscillibacter丰度减少(P<0.05),Peptostreptococcaceae、Romboutsia丰度增加(P<0.05)。中药干预后与模型组的差异菌群为 Actinobacteria、Lachnospiraceae、Anaerostipes、Lachnoclostridium 丰度增加(P<0.05),Peptostreptococcaceae、Clostridiales、Romboutsia丰度减少(P<0.05)。西药干预后与模型组的差异菌群为 Bacilli、Lactobacillales、Lachnopiraceae、Lactobacillus、Roseburia丰度增加(P<0.05),Tenericutes、Mollicutes、Muribaculaceae、Peptostreptococcaceae、Romboutsia、Dubosiella、Clostridiales 丰度降低(P<0.05)。(3)肠紧密连接蛋白表达:Western blot结果显示,与空白对照组相比,模型组ZO-1、Occludin蛋白表达均显著降低(P<0.01);与模型组相比,西药组Occludin蛋白表达升高,有显著差异(P<0.01),ZO-1蛋白表达有升高趋势,差异无统计学意义,中药组ZO-1、Occludin蛋白表达均显著升高(P<0.05,P<0.01);与西药组相比,中药组ZO-1蛋白表达有升高趋势,差异无统计学意义,Occludin蛋白表达升高,有统计学意义(P<0.01)。Q-PCR结果显示,与空白对照组相比,模型组ZO-1、OccludinmRNA表达均显著降低(P<0.01);与模型组相比,西药组ZO-1、OccludinmRNA 表达均显著升高(P<0.05,P<0.01),中药组 ZO-1、Occludin mRNA表达均显著升高(P<0.01);与西药组相比,中药组ZO-1 mRNA表达升高,有统计学意义(P<0.01),OccludinmRNA表达有升高趋势,差异无统计学意义。(4)结肠、前额叶LPS、IL-6、TNF-α含量:①结肠:与空白对照组相比,模型组LPS、IL-6、TNF-α含量均显著升高(P<0.01);与模型组相比,中药组LPS、IL-6、TNF-α含量均明显降低(P<0.01),西药组LPS、IL-6含量均显著降低(P<0.01,P<0.05),TNF-α含量有降低趋势,差异无统计学意义;与西药组相比,中药组LPS、IL-6、TNF-α含量均明显降低(P<0.01)。②前额叶:与空白对照组相比,模型组LPS、IL-6、TNF-α含量均显著升高(P<0.01);与模型组相比,中药组LPS、IL-6、TNF-α含量均明显降低(P<0.01),西药组LPS、IL-6含量均显著降低(P<0.01),TNF-α含量有降低趋势,差异无统计学意义;与西药组相比,中药组LPS、IL-6含量均明显降低(P<0.01)。(5)结肠、前额叶TLR4/NF-K B信号通路关键蛋白表达:①结肠:Western blot结果显示,与空白对照组相比,模型组结肠TLR4、NF-κB蛋白表达均显著升高(P<0.01);与模型组相比,西药组结肠TLR4蛋白表达有降低趋势,差异无统计学意义,NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.01),中药组TLR4、NF-κB蛋白表达均显著降低(P<0.01);与西药组相比,中药组TLR4蛋白表达显著降低(P<0.01);Q-PCR结果显示,与空白对照组相比,模型组结肠TLR4mRNA、NF-κB mRNA表达均显著升高(P<0.01);与模型组相比,西药组结肠TLR4 mRNA表达有降低趋势,差异无统计学意义,NF-K B mRNA表达显著降低(P<0.05),中药组TLR4 mRNA、NF-K B mRNA表达均显著降低(P<0.01);与西药组相比,中药组TLR4 mRNA、NF-κBmRNA表达均显著降低(P<0.01)。②前额叶:Western blot结果显示,与空白对照组相比,模型组前额叶TLR4、NF-κB蛋白表达均显著升高(P<0.01);与模型组相比,西药组前额叶TLR4、NF-κB蛋白表达有降低趋势,差异无统计学意义,中药组TLR4蛋白表达显著降低(P<0.01),NF-κB蛋白表达有降低趋势,差异无统计学意义;中西药组间相比无明显差异。Q-PCR结果显示,与空白对照组相比,模型组前额叶TLR4、NF-κB mRNA表达均显著升高(P<0.01);与模型组相比,西药组前额叶TLR4、NF-K B mRNA表达均显著降低(P<0.05,P<0.01),中药组TLR4、NF-K B mRNA表达均显著降低(P<0.01);与西药组相比,中药组前额叶皮层TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达均显著降低。结论(1)肝郁脾虚抑郁大鼠存在肠道菌群紊乱,肠粘膜屏障损伤,肠道及前额叶皮层炎症反应;醒脾解郁方可增加肠道菌群丰度,将肝郁脾虚抑郁大鼠肠道菌群结构调整至接近正常状态,同时能够增加肠紧密连接蛋白,减轻结肠及前额叶皮层的炎症反应,并且在一定程度上优于艾司西酞普兰。(2)醒脾解郁方在改善肠道微生态的同时可显著降低TLR4/NF-κB信号通路关键蛋白表达,提示醒脾解郁方的效应机制可能是通过调节肠道微生态,抑制TLR4/NF-κB信号通路,从而改善机体低度炎症状态发挥防治抑郁效应。