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研究背景胃癌是世界范围内最常见的癌症之一,在全球癌症发病率中排名第五,死亡率中排名第四。由于缺乏有效的早期分子诊断方法,胃癌患者被发现时通常已经处于晚期,这极大降低了胃癌患者的五年生存率。幽门螺杆菌感染是公认的胃癌诱因之一,在慢性浅表性胃炎-萎缩性胃炎伴肠化生-不典型增生-胃癌这个发展过程中发挥了重要作用,但其中的具体机制仍有待进一步研究。Wnt/β-catenin信号通路是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路,在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生等生理过程中具有至关重要的作用。另外,Wnt/β-catenin信号通路还参与了肿瘤发生、发展的病理过程,包括促进肿瘤细胞的增殖和凋亡、侵袭和迁移、肿瘤干细胞的自我更新及肿瘤的化疗耐药等。铁死亡是近年来发现的一种新型程序性细胞死亡方式,以铁依赖的脂质过氧化物积累为特征。铁死亡发生的过程中细胞抗氧化能力下降、氧化还原水平失衡,进而发生细胞膜脂质过氧化反应,从而损伤细胞膜的完整性,导致细胞死亡。铁死亡与多种肿瘤的发生发展密切相关,许多研究已证实铁死亡在杀死癌细胞和抑制癌细胞生长中的重要作用。阿糖胞苷、顺铂、阿霉素等化疗药物联合应用铁死亡诱导剂对其抗肿瘤活性有显著的协同作用。因此深入研究铁死亡通路的分子机制,对肿瘤的治疗和抗癌药物的研发均具有重要意义。目前对于Wnt/β-catenin信号通路与铁死亡之间的关系研究较少,因此我们对幽门螺杆菌激活的Wnt/β-catenin信号通路是否调控铁死亡,Wnt/β-catenin信号通路调控的铁死亡在胃癌发生、发展中的作用以及Wnt/β-catenin信号通路调控铁死亡的具体机制进行了研究。研究目的探究Wnt/β-catenin信号通路与铁死亡在胃癌的发生发展过程中所发挥的作用,阐明Wnt/β-catenin信号通路调控铁死亡在胃部恶性转化中的具体机制以及幽门螺杆菌在其中的作用,进一步研究Wnt/β-catenin信号通路调控铁死亡与胃癌化疗耐药的关系,为增强肿瘤的化疗敏感性提供新策略。方法和结果（一）抑制Wnt/β-catenin信号通路可特异性增强胃癌细胞对铁死亡的敏感性CCK-8细胞活性检测与流式细胞术细胞死亡检测发现使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂LF3后可特异性增强胃癌细胞对铁死亡的敏感性。MDA、4-HNE与脂质活性氧水平检测发现抑制Wnt/β-catenin信号通路可增加细胞脂质过氧化水平,从而诱导胃癌细胞发生铁死亡。（二）Wnt/β-catenin信号通路中的关键转录因子TCF4抑制胃癌细胞铁死亡通过对TCGA数据库、GEO数据库以及临床标本中TCF4表达的分析发现TCF4在胃癌中表达升高,高表达组预后较差。随后通过构建TCF4基因敲除细胞系、TCF4过表达细胞系,检测对照细胞与TCF4-KO细胞、TCF4过表达细胞对于铁死亡的敏感性及细胞的脂质过氧化水平,发现TCF4敲除后可以增加胃癌细胞的脂质过氧化水平,提高胃癌细胞对铁死亡的敏感性;而TCF4过表达则可以降低胃癌细胞的脂质过氧化水平,导致胃癌细胞对铁死亡抵抗。（三）TCF4通过调控GPX4进而抑制胃癌细胞铁死亡通过ChIP Seq测序发现TCF4可以结合在铁死亡核心基因GPX4的启动子区,在TCGA数据库、GEO数据库以及临床标本中检测GPX4的表达,发现GPX4在胃癌中表达升高。克隆形成、EdU、划痕实验、transwell实验证实,敲低GPX4可以抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移。通过构建GPX4基因敲除胃癌细胞系,并分别在对照细胞与GPX4-KO细胞中过表达TCF4,检测MDA的水平与胃癌细胞的集落形成能力,发现过表达TCF4能够降低胃癌细胞脂质过氧化水平,增强胃癌细胞集落形成的能力;GPX4敲除时,过表达TCF4对胃癌细胞铁死亡的影响被消除。通过检测LF3处理或敲除TCF4的胃癌细胞分别对Erastin和RSL3的敏感性,发现胃癌细胞对Erastin和RSL3诱导的铁死亡的敏感性不同,证实TCF4通过GPX4依赖的方式调控胃癌细胞铁死亡。（四）β-catenin/TCF4以转录复合体的形式结合在GPX4的启动子区调控其转录实时定量PCR与Western Blot实验证实,过表达TCF4后,GPX4的mRNA水平与蛋白水平明显升高;敲除TCF4后,GPX4的mRNA水平与蛋白水平明显降低。双荧光素酶实验与染色质免疫共沉淀实验证实,TCF4可以直接结合在GPX4的启动子区并调控其转录。随后为了探究β-catenin是否参与TCF4对GPX4的调控过程,敲低β-catenin后进行实时定量PCR与Western Blot实验,发现GPX4的mRNA水平与蛋白水平明显降低。使用抑制剂或转染TCF4突变型质粒后,废除β-catenin与TCF4之间的结合,进行实时定量PCR与Western Blot实验,发现β-catenin/TCF4转录复合体对GPX4的转录调控作用消失。（五）体外抑制TCF4可增强胃癌细胞对顺铂的敏感性CCK-8细胞活性检测发现使用敲除TCF4后可增强胃癌细胞对顺铂的敏感性,过表达TCF4后可降低胃癌细胞对顺铂的敏感性。MDA水平检测、ELISA实验发现顺铂可增加细胞脂质过氧化水平。（六）体内抑制Wnt/β-catenin信号通路可以增强肿瘤对顺铂的敏感性裸鼠皮下成瘤实验证实,通过体内敲除TCF4或使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂LF3抑制Wnt/β-catenin信号通路后,可提高肿瘤的脂质过氧化水平,增强肿瘤对顺铂的敏感性,促进顺铂诱导的铁死亡的发生。（七）幽门螺杆菌感染可通过TCF4上调GPX4的表达幽门螺杆菌感染胃癌细胞后检测细胞内MDA、脂质活性氧、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的水平,结果显示幽门螺杆菌感染可抑制肿瘤细胞的脂质过氧化水平,升高肿瘤细胞内还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例,进而影响肿瘤细胞铁死亡的发生。实时定量PCR与Western Blot实验证实,幽门螺杆菌感染可以以时间和浓度依赖的方式促进TCF4与GPX4的mRNA、蛋白表达,且TCF4介导了幽门螺杆菌对GPX4的表达上调。幽门螺杆菌小鼠灌胃的免疫组化染色发现,幽门螺杆菌灌胃组TCF4、GPX4的表达升高。幽门螺杆菌阳性与阴性的人体胃炎标本实时定量PCR检测发现,幽门螺杆菌阳性组TCF4、GPX4的表达升高。研究结论本研究发现,幽门螺杆菌能够激活Wnt/β-catenin信号通路,上调转录因子TCF4的表达,进而通过β-catenin/TCF4转录复合体促进GPX4的转录,从而抑制胃癌细胞的脂质过氧化水平,抑制由化疗介导的铁死亡的发生。通过使用抑制剂或敲除TCF4,靶向Wnt/β-catenin信号通路,可以抑制铁死亡核心基因GPX4的表达,促进胃癌细胞对化疗诱导的铁死亡的敏感性。本研究为铁死亡的转录调控提供了一种新机制,也为增强顺铂等化疗药物的疗效提供了一种新途径。