在我国,棉花作为一种重要的经济作物被广泛种植。研究棉花纤维发育的分子调控机制,通过转基因技术提高棉花纤维产量和品质,具有重要意义。棉花纤维发育受到外界环境以及内源激素的影响,以往的研究表明,油菜素内酯(BR)在棉花纤维发育过程中发挥重要作用。MYB转录因子作为一种植物中广泛存在的转录因子,对棉花纤维生长发育具有重要调控作用。本实验室利用酵母双杂交技术对棉花纤维的cDNA文库进行筛选,鉴定出一个能与棉花14-3-3e蛋白相互作用的蛋白,命名为GhMYB Like2。本文对GhMYB Like2转基因棉花后代株系的遗传表型及其相关分子机制进行了研究,获得的主要结果如下:1、GhMYBLike2蛋白亚细胞定位分析GhMYB Like2基因的ORF区长为1086 bp,编码361个氨基酸,在第16位至61位氨基酸序列之间有一个MYB-DNA-binding区域,在第70位至112位氨基酸序列之间也有一个MYB-DNA-binding区域,表明它属于R2R3-MYB蛋白。为了探究GhMYB Like2蛋白在生物体内的亚细胞定位情况,构建了 GhMYB Like2与eGFP的融合表达载体,并转入农杆菌GV3101细胞中。将农杆菌液注射入幼嫩的烟草叶下表皮,经过2-3天的培养,取下幼嫩的烟草叶下表皮,在共聚焦显微镜下观察到GFP荧光主要存在于细胞核中,这表明GhMYB Like2蛋白定位于细胞核,可能是一个转录调控因子。2、GhMYBLike2转基因棉花的后代表型分析为探究GhMYB Like2基因在棉花纤维发育中的功能,对T2代和T3代GhMYB Like2 RNAi转基因棉花进行了遗传分析。提取开花后9天的棉花纤维RNA,通过实时定量RT-PCR检测发现,相对于野生型,GhMYB Like2在RNAi转基因棉花纤维中表达量发生了显著下调。利用徒手切片技术,观察GhMYBLike2RNAi转基因棉花开花当天的胚珠,发现GhMYB Like2 RNAi转基因棉花纤维细胞突起迟缓。GhMYB Like2 RNAi转基因棉花植株在叶片形态、棉桃大小和成熟种子大小等表型方面与野生型植株相比没有明显差别,这说明GhMYBLike2基因沉默并不影响棉花植株的相关农艺性状。对GhMYBLike2 RNAi转基因棉花成熟纤维长度进行了测量及纤维品质分析,发现GhMYB Like2 RNAi转基因棉花成熟纤维长度显著变短。相较于野生型,几个RNAi株系棉纤维长度分别减少10.33%、9.58%、8.31%、5.57%、10.42%和10.99%,而且断裂比强度也减小,而马克隆值增加。这说明了 GhMYB Like2在棉纤维发育过程中发挥重要的调控作用。3、GhMYB Like2 RNAi转基因棉花纤维转录组分析提取GhMYBLike2RNAi转基因棉花和野生型棉花开花后9天的纤维RNA,进行转录组测序分析。结果表明,与野生型相比,RNAi株系1中表达量显著变化的基因有1451个,其中上调的基因有766个,下调的基因有688个;RNAi株系2中表达量显著变化的基因有767个,其中上调的基因有601个,下调的基因有166个。在这些表达量发生显著变化的基因中,RNAi株系1与2共有的差异基因有123个。分析野生型和两个RNAi转基因株系开花后9天棉纤维中的差异基因,发现有24个BR信号相关的基因表达发生了明显变化。其中,有5个基因的表达量在GhMYB Like2 RNAi转基因棉纤维中显著上调,这说明GhMYB Like2可能是BR信号通路中的一个重要调节因子。通过KEGG生物信息学数据库,对上述差异表达基因进行分类,发现这些基因主要编码一些转录因子、氧化还原酶、纤维素合成酶、木质素合成酶等,它们大部分参与调控细胞伸长与分化。此外,也发现这些差异表达基因参与植物激素信号转导过程、木质素生物合成代谢过程、类黄酮生物合成代谢过程、苯丙氨酸生物合成代谢过程、热激蛋白生物合成代谢过程、转录调节过程、氧化还原作用及催化过程等,表明GhMYB Like2在棉纤维发育中发挥重要的调控作用。4、GhMYB Like2与GhMPK6/9蛋白相互作用分析有文献报道MYB转录因子往往受到MPK蛋白激酶的磷酸化作用,从而发挥其调控功能。分析发现,GhMYB Like2和一些GhMAPKs在棉纤维发育过程中共表达,GhMPK3、GhMPK5、GhMPK6、GhMPK9和GhMP2 在棉纤维中的表达模式与GhMYB Like2的表达模式相似。因此推测GhMYB Like2蛋白可能与这些GhMPKs蛋白相互作用从而被其磷酸化而发挥功能。利用双分子荧光互补技术进行蛋白质相互作用分析证实了GhMYB Like2能够与GhMPK6和GhMPK9发生相互作用。同时,通过体外pull-down实验,进一步证明GhMYB Like2与GhMPK6和GhMPK9存在相互作用。