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半乳糖苷酶是降解蜜二糖、乳糖和棉籽糖等含有半乳糖苷键的糖苷水解酶,该酶在食品、医疗和饲料等行业具有重要的应用。特殊环境来源的微生物有环境适应性,其产生的半乳糖苷酶具有潜在的特殊性质。本课题从盐碱湖、红树林和火焰山分离菌中克隆得到4个半乳糖苷酶基因,其中3个半乳糖苷酶基因在大肠杆菌或酵母中得到异源表达,同时对表达的重组半乳糖苷酶进行纯化和酶学性质研究。主要内容如下:1、以豆粕或乳糖为唯一碳源的筛选培养基,从盐碱湖、红树林和火焰山分离菌筛选到7株产半乳糖苷酶微生物。利用简并引物从3株产酶微生物克隆到4个半乳糖苷酶基因片段,这些片段的氨基酸序列与已知半乳糖苷酶的最高一致性在74%～100%。2、采用TAIL-PCR或同源克隆的方法获得4个半乳糖苷酶基因的全长,设计特异性引物,PCR扩增4个半乳糖苷酶基因,并进行生物信息学分析:半乳糖苷酶基因agalSL3-GH27、bgalSL3-GH42、agalMF5-GH27和bgalFM3-GH2的长度分别为1167、2058、1311和3045 bp,分别编码388、685、436和1014个氨基酸酸,与已知半乳糖苷酶蛋白最高一致性分别为99%、97%、99%和71%。3、纯化的重组仅-半乳糖苷酶rAgalSL3-GH27主要酶学性质:最适反应pH是5.5,在pH 5.0～10.0有很好的稳定性;最适反应温度55。℃C,在55℃以下保持好的热稳定性;在低于1.5 mol·L-1的NaCl溶液中,重组酶基本不受影响;在3 mol·L-1的NaCl和KCl溶液中有很好的稳定性;水解PNPG的比活、Km、Vmax和Kcat分别为379.78 ±5.80 U·mg-1、2.61±0.02 μmol·mL-1、452.30±0.57μmol·(mg·min)-1和345.53 ±1.27 s-1;该酶可水解蜜二糖和棉籽糖,不能水解ONPG和瓜尔豆胶4、纯化的重组β-半乳糖苷酶rBgalSL3-GH42主要酶学性质:最适反应pH为6.5,在pH 6.0～9.0保持好的稳定性;最适反应温度40℃,在40℃以下保持稳定;NaCl对重组酶的影响较小,在1.5 mol·L-1的NaCl溶液中有较好的稳定性;重组酶水解ONPG的比活、Km、Vmax和Kcat 分别为354.48 ±7.68 U·mg-1、10.76±0.38μmoL·mL-1、833.33±1.21 μmol·(mg·min)-1和1110.42±1.36 s-1;重组酶水解乳糖,不能水解PNPG。5、纯化的重组α-半乳糖苷酶rAgalMF5-GH27主要酶学性质:最适反应pH是4.5,在pH 4.0～8.0有较好的稳定性;最适反应温度为50℃C,在50℃以下保持较好的稳定性;水解PNPG的比活、Km、Vmx脈和Kcat分别为87.45±0.10 U·mg-1、0.15±0.01μmol·mL-1、80.13±0.02 μmol-(mg-min)-1和80.51±0.05 s-1;重组酶水解棉籽糖、蜜二糖及瓜尔豆胶的相对酶活力分别为1.04%、3.75%及2.31%。