论文部分内容阅读
目的:利用基因工程技术构建人参胚胎发育晚期丰富蛋白(Panax ginseng lateembryogenesis abundant proteins,PgLEA蛋白)植物表达载体并建立稳定的转基因拟南芥株系,研究该基因对逆境胁迫的抵抗作用,为人参抗逆育种提供候选基因。 方法:从转录组数据中获得PgLEA基因序列。通过RT-PCR技术对PgLEA目的基因进行扩增,将扩增产物进行TA克隆、基因测序以及构建pCAMBIA1303-PgLEA植物表达载体。农杆菌介导花序浸蘸法将目的基因导入拟南芥,经潮霉素抗性筛选及分子鉴定获得转基因阳性植株,连续筛选3代获得稳定的转基因拟南芥株系。对植株苗期进行非生物胁迫处理及相关生理指标检测。RT-qPCR分析逆境胁迫前后转基因拟南芥自身抗胁迫相关基因表达量变化情况。 结果:1、成功扩增出PgLEA目的基因,全长为942 bp,编码314个氨基酸,理论分子量为34.5 kDa。 2、成功构建了pCAMBIA1303-PgLEA植物表达载体。经潮霉素筛选、PCR检测、Western bolt检测表明PgLEA基因在转基因拟南芥中成功转录翻译。 3、抗旱实验表明转PgLEA基因的拟南芥比野生型拟南芥有更强的抗旱能力。干旱胁迫下,与野生型相比,转基因拟南芥叶片过氧化氢含量明显降低,过氧化氢酶含量明显升高。 4、抗盐实验说明转PgLEA基因的拟南芥比野生型拟南芥有更强的抗盐能力。高盐胁迫下,与野生型相比,转基因拟南芥脯氨酸含量显著升高,电解质率显著降低。 5、RT-qPCR分析逆境胁迫下胁迫相关基因的表达量结果为:在干旱胁迫下转基因拟南芥中RD29A、COR47、KIN、RD19A的表达量极显著高于野生型拟南芥;在高盐胁迫下转基因拟南芥中RD29A、RD19A极显著高于野生型拟南芥。这些结果表明PgLEA具有促进植物抗旱和抗盐能力,促进抗逆效应基因的表达。 结论:PgLEA基因具有改善植株生长中适应外界不利环境的能力,可以作为改善人参适应外界环境的备选基因。