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维甲酸(retinoic acid，RA)是哺乳动物体内重要的激素类物质，RA由维生素A(也称视黄醇)经两步氧化脱氢酶促反应产生，中间产物是视黄醛。辅酶Ⅱ依赖性视黄醛脱氢／还原酶(NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase／reductase，NRDR)是黄东阳教授从兔肝中纯化出的一种酶，该酶普遍存在于哺乳动物肝脏中，显示出较强的视黄醇氧化与视黄醛还原活性。此外，NRDR还催化视黄醛以外的许多醛、酮类化合物的还原反应。生物信息学分析显示NRDR蛋白N末端含有线粒体定位信号(mitochondrial targeting signal，MTS)，C末端含有过氧化物酶体定位信号(peroxisomal targeting sequence type 1，PTS1)。hNRDRA2是从人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH中发现的一种亚型，简称A2。它相对于NRDR缺第4、6外显子，从第5外显子开始读码框架前移1bp，导致蛋白翻译提前终止，并失去C端PTS1，而在C端附近出现核定位信号(nuclear localization signal，NLS)。根据课题组前期研究结果和序列分析，兔NRDR因翻译起始位点选择及翻译后加工的不同，可能存在三种蛋白形式，所含氨基酸数目分别为279、260及256。蛋白在细胞内的定位与其体内活性直接相关，蛋白定位的改变通常会导致功能相应的改变。因此，研究NRDR及其选择性剪接亚型在细胞内的定位对了解其功能具有重要意义。本研究构建了A2的原核表达质粒，在大肠杆菌中重组表达A2，重组蛋白免疫家兔得到抗血清。利用融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的真核表达载体，外源重组表达A2及兔NRDR蛋白(279／260／256)，观察不同融合方式下A2及兔NRDR的定位。同时外源表达天然状态(native)A2，利用制备的抗血清进行免疫荧光定位。为深入了解A2的定位信号功能及定位机制，本研究还构建了NLS序列及A2的多种截短片段的GFP融合表达质粒，来分析A2定位信号的功能及各区段对定位的影响。原核表达A2重组蛋白作为免疫原，制备得到了高滴度的兔抗血清。虽然NLS序列与GFP的融合蛋白集中分布在细胞核，GFP融合的A2并没有定位到核，而是分布于细胞质。分析A2各区段对定位的影响，结果表明A2与人NRDR的一致序列会影响A2的定位。利用兔抗血清进行免疫荧光检测，外源表达native A2呈点状分布在细胞质，与Flag融合A2的分布一致。N端融合GFP的兔NRDR均分布于过氧化物酶体，而C端融合GFP的兔NRDR260则均匀分布于细胞质。