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目的:神经管畸形（Neural tube defects,NTDs）是由神经管闭合障碍引起的一种常见的先天性出生缺陷疾病,严重影响了人口质量,但其病因复杂,发病机制尚不清楚,因此,深入研究NTDs的发病机制对于降低出生缺陷、提高人口质量意义重大。本研究的目的主要有:1揭示维甲酸（Retinoic acid,RA）诱导的NTDs鼠胚的转录组谱变化,筛选出NTDs相关的重要差异表达基因。2重点研究Hox基因在NTDs中的变化规律,探讨组蛋白H3K27me3甲基化修饰对Hox基因的调控作用,从表观遗传角度阐释环境因素影响NTDs发生的机制。另外,初步探讨Nr2e1基因在RA诱导的NTDs发生中的作用及机制。方法:1采用RNA-seq技术测定NTDs鼠胚转录组谱变化。1.1采用28mg/kg RA于小鼠胚胎7.5天（E7.5d）时对孕鼠进行灌胃构建NTDs鼠胚模型,对照组孕鼠采用同等剂量香油进行灌胃,分别于E8.5d、E9.5d和E10.5d分离鼠胚脑泡组织,采用Illumina HiSeqTM 2000测序平台进行转录组谱的测定。1.2采用RPKM法计算基因表达量,将FDR≤0.001且Log2Ratio≥1的基因定义为差异表达基因,并进行GO和KEGG pathway显著性富集分析,了解差异表达基因参与的生物学过程及信号代谢通路。1.3通过取交集的方法筛选出在E8.5d、E9.5d和E10.5d均为差异表达的基因,即与NTDs相关的差异表达基因,并通过RT-PCR和RT-qPCR对筛选基因进行表达量验证。2rna-seq测序数据中hox基因呈现整体上调,本研究将重点围绕显著差异表达的hox基因进行深入探讨。2.1采用rt-qpcr检测ra干预的ntds鼠胚脑泡组织及sv/129小鼠胚胎干细胞（escs）和c57bl/6鼠胚神经干细胞（nscs）中的hox基因mrna水平。2.2采用westernblot检测ra干预的ntds鼠胚脑泡组织及escs和nscs中的h3k27me3修饰水平。2.3采用rt-qpcr检测ra干预的ntds鼠胚脑泡组织及escs和nscs中的h3k27me3甲基化转移酶ezh2和去甲基化酶kdm6a和kdm6b的mrna水平。2.4采用chip-qpcr检测ra干预的escs中h3k27me3在hox基因启动子区的富集情况。2.5采用nanostring技术检测临床ntds标本中hox基因的表达情况,采用westernblot检测h3k27me3修饰水平。3对rna-seq数据中表达丰度最高、差异倍数最大的下调差异表达基因nr2e1的作用和机制进行初步探讨。3.1采用全胚胎原位杂交和rt-pcr技术对ra诱导的ntds鼠胚nr2e1基因时空表达模式进行检测。3.2通过集落形成、cck-8、流式细胞技术和免疫荧光等方法比较正常组和ntds组分离出的两种nscs的增殖和分化能力,并采用rt-pcr和westernblot技术检测nr2e1基因在两种nscs中的表达情况。3.3采用慢病毒作为nr2e1shrna的载体转染正常组nscs,通过集落形成计数和cck-8法检测nr2e1基因对nscs增殖的影响,通过免疫荧光法计数map2和gfap阳性细胞,检测nr2e1基因对nscs向神经元和星形胶质细胞分化的影响。结果:1ntds鼠胚转录组谱的变化情况。1.1brc85-vs-bra85检测到587个差异表达基因,上调296个,下调291个;brc95-vs-bra95检测到2256个差异表达基因,上调1782个,下调474个;brc105-vs-bra105检测到2337个差异表达基因,上调1464个,下调873个。1.2经过go功能性富集分析,发现差异表达基因主要与轴突、细胞连接、细胞膜及细胞外基质等细胞成分相关,与结合能力、通道活性及转运能力等分子功能相关,与组织器官发育过程、细胞发育、分化和迁移等生物学过程相关,但各时期差异表达基因富集的goterms略有不同。1.3经过keggpathway富集分析,发现差异表达基因主要参与轴突导向、基底细胞癌、细胞粘附分子、胆碱能突触、hedgehog信号通路、糖酵解/糖异生等pathway。1.4通过取交集的方法,筛选到了196个在3个时期均有差异表达的基因,根据基因表达模式大致分为2类,以上调为主的基因和以下调为主的基因。其中,上调基因主要参与识别、细胞分化和前/后轴模式特异化等生物学过程,而下调基因主要参与中枢神经系统（cns）发育、神经元分化、神经元产生、神经发生等生物学过程。1.5将差异倍数增加至20倍,筛选出了26个在ntds发生过程中呈现显著差异表达的基因,其中25个基因得到了rt-qpcr验证。2hox基因的h3k27me3调控通路在ntds发生中的作用。2.1在前期rna-seq测序数据中,筛选了10个差异倍数大于20倍的hox基因,其在ntds发生过程中较正常组鼠胚均呈现表达上调,并且这种变化趋势在ra干预的sv/129鼠escs和c57bl/6鼠nscs中得到了验证。2.2ra干预的escs和nscs中及鼠胚脑泡组织中均显示h3k27me3水平显著下降,进一步研究发现h3k27me3修饰水平降低是由甲基化转移酶ezh2表达降低而去甲基化酶kdm6b表达升高引起。2.3chip-qpcr结果显示,在ra干预下h3k27me3与10个hox基因的结合能力均减弱,即h3k27me3修饰水平发生降低,引起了下游hox基因的表达上调。2.4临床无脑畸形样本中的hox基因呈现整体上调,并且h3k27me3修饰水平发生下降,其中hoxc4和hoxd1表达与h3k27me3修饰水平呈现显著负相关性。3nr2e1在ra诱导的ntds发生中的作用。3.1全胚胎原位杂交结果显示,nr2e1主要表达在鼠胚前脑,正常发育过程中表达逐渐增高,而在ntds鼠胚中几乎没有变化;rt-pcr结果也显示nr2e1在ntds胚胎中的表达显著低于正常组。3.2集落计数和CCK-8结果显示正常组NSCs的增殖能力显著高于NTDs组NSCs;FCM结果表明NTDs组NSCs的细胞被捕获在了G1期,无法进入S期（即DNA合成期）;免疫荧光结果表明NTDs组NSCs向神经元和星形胶质细胞分化的能力都显著低于正常组,说明NTDs组的NSCs是受损的细胞。RT-PCR和Western blot结果显示,Nr2e1在NTDs组NSCs中表达显著低于正常组NSCs。3.3 LV3-Nr2e1 shRNA转染NSCs,结果表明抑制Nr2e1表达显著降低了NSCs的增殖能力,并且使NSCs向神经元分化能力减弱,而向星形胶质细胞分化能力增强,即NSCs分化发生紊乱。结论:1 RA诱导的NTDs鼠胚转录组谱发生了显著变化,筛选出25个与NTDs相关的显著差异表达基因,其中10个Hox基因发生上调,Nr2e1基因表达丰度最高且下调倍数最明显。2 Hox基因在NTDs鼠胚中呈现整体表达上调趋势,其表达紊乱受到了H3K27me3的调控,并且这种Hox基因的表观遗传调控机制在临床无脑畸形的发生中具有重要作用,从组蛋白甲基化修饰角度为NTDs的发生提供新的表观遗传调控机制。3 Nr2e1基因表达下调,可引起NSCs增殖和分化障碍,参与RA诱导的NTDs发生。