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κ-卡拉胶是一种天然线性硫酸多糖,主要来源于海洋红藻;κ-卡拉胶的水解产物κ-卡拉胶寡糖,具有良好的生物利用度,表现出了多种生物药理活性。采用生物酶法水解κ-卡拉胶,是制备κ-卡拉胶寡糖的有效技术手段。κ-卡拉胶酶（EC 3.2.1.83）是一类糖苷水解酶,可以专一性的水解κ-卡拉胶,从而选择性制备结构完整、分子量均一的κ-卡拉胶寡糖。κ-卡拉胶酶的开发和利用面临的主要问题是:产生κ-卡拉胶酶的微生物资源发掘不足,限制了κ-卡拉胶酶的深入研究;微生物产酶量低,需要利用生物技术实现κ-卡拉胶酶的大量制备和重复利用。针对以上问题,本论文重点开展以下研究:通过产κ-卡拉胶酶微生物的筛选,发掘酶资源;通过酶学特性分析结合分子生物学和生物信息学技术,高效制备κ-卡拉胶酶;利用酶工程技术,实现κ-卡拉胶酶的重复利用。本研究对于实现κ-卡拉胶寡糖的工业化生产和应用具有重要意义,主要研究内容及结果如下:（1）κ-卡拉胶酶产生菌的分离鉴定及产酶条件优化通过富集培养和筛选分离,从大连沿海（N38°52′,E121°33′）采集的腐烂海藻中分离得到多株具有κ-卡拉胶降解能力的菌株,比较菌株降解能力等特性,确定将菌株ZDY3作为研究对象。通过16S r DNA鉴定和系统发育树构建,确定菌株ZDY3属于假交替单胞菌属,命名为Pseualteromonas sp.ZDY3。对菌株ZDY3的生长及产酶条件进行了优化,优化后Pseualteromonas sp.ZDY3的发酵液上清中κ-卡拉胶酶活力提高到2.9 U/m L。（2）κ-卡拉胶酶的分离纯化及酶学特性表征通过硫酸铵分级沉淀、Q FF阴离子交换层析和Superdex 75分子筛凝胶过滤层析,从Pseudoalteromonas sp.ZDY3发酵液上清中分离纯化出一种天然κ-卡拉胶酶Cgk ZDY3-N。通过肽指纹图谱、分子生物学方法并结合生物信息学分析,获得了全长κ-卡拉胶酶Cgk ZDY3-FL的基因序列以及该酶的一级结构序列,Cgk ZDY3-FL具有κ-卡拉胶酶特征性催化三联体（E162-D164-E167）。结合Cgk ZDY3-FL的理论分子量（44997.03 Da）和Cgk ZDY3-N的精确分子量（31702.69 Da）,确定天然κ-卡拉胶酶Cgk ZDY3-N由275个氨基酸组成（N26-T300）。Cgk ZDY3-N的酶学特性分析表明Cgk ZDY3-N是一种冷适应型κ-卡拉胶酶,其最适反应温度为45℃,最适反应p H 8.0,经ESI-Q-TOF-MS鉴定其水解终产物为κ-新卡拉二糖和κ-新卡拉四糖。（3）κ-卡拉胶酶的重组表达及模块功能分析分析全长κ-卡拉胶酶Cgk ZDY3-FL氨基酸序列,确定Cgk ZDY3-FL由信号肽（SP模块,1-25 aa）、GH16κ-卡拉胶酶家族结构域（GH16模块,31-294 aa）以及未被表征的Yjd B superfamily蛋白结构域（Yjd B模块,325-407 aa,COG5492）三个模块组成。采用截短表达的策略,构建了含有不同模块的重组质粒,结合酶学特性分析,研究不同模块对重组酶表达及功能特性的影响,结果表明:GH16模块是κ-卡拉胶酶行使催化作用的关键模块,SP模块可以被大肠杆菌表达系统识别,Yjd B模块有助于重组酶在大肠杆菌细胞内进行折叠,SP模块和Yjd B模块的协同作用有助于重组酶的胞外分泌和可溶性表达。通过重组表达、酶学特性分析,获得了在大肠杆菌中高效表达的热稳定重组κ-卡拉胶酶Cgk PZ,结合分子动力学模拟,确定了酶结构与功能之间的关系。（4）κ-卡拉胶酶的固定化通过分子动力学模拟,探究了金属离子对于κ-卡拉胶酶结构和功能的影响,结果表明κ-卡拉胶酶Cgk PZ与Ca2+的结合可能提高κ-卡拉胶酶的催化效率。圆二色光谱分析结果表明,在存在Ca2+的条件下,κ-卡拉胶酶的二级结构会发生变化。利用自组装技术,合成了κ-卡拉胶酶-无机杂化纳米花固定化酶Ca NF@Cgk PZ,并采用分析技术对固定化酶的结构特征进行了分析。Ca NF@Cgk PZ的催化效率(kcat/Km)为382.1 m L·mg-1·s-1,约为游离κ-卡拉胶酶的3倍,催化效率的提高与分子动力学模拟的分析结果一致。Ca NF@Cgk PZ的酶活性在使用19个周期后,没有显著变化;在4-25℃下储存15天后,其相对活性仍保持在70-100%。采用TLC和ESI-Q-TOF-MS分析,固定化酶的水解产物与游离酶一致,为κ-新卡拉二糖和κ-新卡拉四糖。综上所述,本论文研究了Pseudoalteromonas sp.ZDY3来源的天然κ-卡拉胶酶Cgk ZDY3-N的酶学特性,并解析了全长κ-卡拉胶酶Cgk ZDY3-FL的氨基酸序列信息;通过对全长κ-卡拉胶酶Cgk ZDY3-FL的功能模块进行分析,发现Cgk ZDY3-FL的SP模块和Yjd B模块对κ-卡拉胶酶高效表达具有促进作用;获得了可在大肠杆菌中高效表达的热稳定重组κ-卡拉胶酶Cgk PZ;基于Ca2+对κ-卡拉胶酶结构和功能的影响,合成了一种新型自组装κ-卡拉胶酶-无机杂化纳米花,显著提高了κ-卡拉胶酶的催化效率和重复利用性。