花翅摇蚊N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶多克隆抗体的制备及其适用性初探

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摇蚊等水生节肢动物在生长发育过程中,会不断的将包含N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)在内的蜕皮液释放到水中,其释放量可以作为指示生物生物量的指示因子。因此,为了检测摇蚊生长过程中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)在水中的释放量,经过0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.2)提取,60%-100%硫酸铵沉淀,DEAE SephadexA-25阴离子交换柱层析和SephadexG-150分子筛柱层析,从花翅摇蚊(Chironomus kiiensis)体内提纯了N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase),并达到了电泳纯,其亚基分子量约为13 kD。以粗提物为起点,酶的纯化倍数和纯化回收率分别为33.03倍和10.86%,纯化产物的比活力为8.06U/mg。酶促反应的米氏常数Km为0.1003mmol/L,最大反应速度Vm为0.2512μ mol/(L·min)。酶催化底物分解的最适pH为6.0且在pH5.0-8.0的范围内活性处于高位;酶催化底物分解的最适反应温度为45℃且在不高于50℃的温度下处理60 min,酶活性下降不明显。  用纯化的花翅摇蚊NAGase免疫两只新西兰大白兔,得到效价为1∶10000的兔抗花翅摇蚊NAGase多克隆抗体,运用间接非竞争酶联免疫吸附测定方法定量测定花翅摇蚊NAGase的最适抗原浓度为7.64μg/mL,最适稀释抗血清倍数为1∶10000;测定NAGase-IR的标准曲线为:Y=1.0886(1-e-02762x),相关系数r2=0.9951,标准误差S=0.0257,灵敏度为49.56 ng/mL;不同蛋白浓度的批内、批间和整体的变异系数均小于10%,回收率介于92.18-97.59%之间。  以本实验获得的花翅摇蚊NAGase抗体与来自其他水生节肢动物和藻的NAGase做交叉反应,测得的交叉反应率分别为:隆线溞4.41%,老年低额溞3.12%,多刺裸腹溞3.40%,中华薄壳介4.17%,日本沼虾3.23%,白纹伊蚊7.50%,小球藻<0.2%。这预示所制得的抗体不仅在甲壳纲与昆虫纲之间具有特异性,在昆虫纲的双翅目内部也具有特异性。分别用兔抗人NAGase多克隆抗体和兔抗隆线溞NAGase多克隆抗体与花翅摇蚊NAGase进行反应,它们之间的交叉率分别为1.2%和4.68%。  利用间接非竞争ELISA方法研究了毒死蜱、氰戊菊酯和阿维菌素对花翅摇蚊NAGase释放量的影响,试验结果表明:在所设置的试验浓度下,摇蚊幼虫的生长受到抑制,其NAGase的释放量也相应减少。运用抗体测得3种杀虫剂对于NAGase体外释放量(immunoreactive NAGase protein,NAGase-IR)的12 d EC50分别为1.2012、0.0043和0.6281μg/L,其值略低于以NAGase活力作为测试终点的12 d EC50(1.4765、0.0051和0.6756μg/L)。两者均明显低于以死亡作为测试终点的LC50(4.8171、0.0954和2.1340)。  上述结果表明,NAGase多克隆抗体可以用来更加灵敏和更加特异性地检测农药对花翅摇蚊生长的影响。
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