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一、目的与意义妊娠失败和不孕症的发生率逐年增加,全球每年约有2.3×107例流产患者。尽管多种因素可导致流产,包括染色体异常、精子发育不良、输卵管阻塞、子宫内膜异常和妊娠相关蛋白表达失衡等。但是,目前受到广泛关注的是胚胎发育和功能障碍引起流产,因此探讨正常生理和异常病理中胚胎发育和功能可以为临床诊断和不孕症治疗提供新思路。滋养层细胞系源于囊胚的滋养层,他们良好的增殖和差异分化能力是成功妊娠的关键。胚胎滋养层细胞位于绒毛的最外层,具有使成熟的胚胎定置、黏附和侵入到子宫内膜上皮并驱动胚胎进入更深层的子宫蜕膜组织中,帮助子宫螺旋动脉重铸,从而建立母体与胎儿之间的直接相互作用。胚胎滋养层细胞分为三种亚群;细胞滋养层细胞(cytotrophoblast,CTB)、合体滋养层细胞(syncytiotrophoblast,STB)和绒毛外细胞滋养层细胞(Extravillus trophoblast,EVT),CTB可被诱导分化为STB或EVT。其中,多核STB由CTB融合形成,形成STB壳,环绕胚胎植入部位,与母体血液直接接触,作为营养物质和气体载体、激素分泌和免疫屏障。EVT细胞可以侵入蜕膜组织或侵入血管重铸螺旋状动脉。滋养层细胞的发育和功能异常可导致各种妊娠并发症,包括流产、先兆子痫和胎儿宫内生长受限。CTB融合形成STB过程中自噬激活有助于胞内容物的降解也为细胞提供营养物质和能量。自噬作为细胞器重组和降解的关键机制在维持细胞的正常代谢和内环境稳态中起重要作用。总之,胚胎滋养层功能障碍会导致胚胎植入和胎盘发育的失败,最终导致流产。深入探讨胚胎滋养层细胞迁移、侵袭和合体化过程相关的分子机制对妊娠成功的维持具有重要意义。蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰类型,特异的糖基转移酶作用下将单糖转移至蛋白质上形成糖蛋白的过程。蛋白质的岩藻糖基化是糖基化的重要类型之一,是糖链合成的最后一步,主要包括两种类型:N-岩藻糖基化和O-岩藻糖基化。岩藻糖基转移酶(Fucosyltransferases,FUTs)是将 L-Fucose(GDP-Fuc)转移至糖的受体底物合成岩藻糖基化。根据催化糖链合成的方式不同分为α1,2、α1,3/4、α1,6岩藻糖基转移酶,共13种亚型。分别催化合成α1,2、α1,3/4、α1,6岩藻糖基化。其中,岩藻糖基转移酶Ⅳ(α1,3-fucosyltransferase4,FUT4)催化合成含双岩藻糖修饰的 Lewis Y(LeY,Fucα1-2 Gal-β1-4[Fuc α1-3]GlcNAcβ1)寡糖。糖蛋白上的聚糖不仅影响蛋白质分子的理化性质和空间结构,还影响多种生理和病理过程,包括胚胎发育和植入、免疫反应、病原体识别和肿瘤转移等。中胚层特异性转录同源蛋白(MEST)也称为PEG1,属于α/β水解酶超家族。MEST是由335个氨基酸组成的单链糖蛋白,并且在Asn163处仅有一个N-糖基化位点。MEST作为母体的印记基因在整个胚胎发育期广泛表达,在胚胎发育、胎盘发育以及胎儿生长中起着至关重要的作用。因此,MEST是否存在岩藻糖基化修饰以及其岩藻糖基化是否调节胚胎植入过程中MEST的功能未见报道。本论文应用了糖组学、蛋白质组学和翻译组学等不同方法,旨在阐明α1,3-岩藻糖基化在胚胎植入过程中的分子机制。利用正常早孕妇女与流产患者绒毛组织和血清比较了滋养层中α1,3-岩藻糖基化以及其催化合成的LeY寡糖含量。利用胚胎滋养层细胞系和小鼠模型,探讨糖蛋白质的α1,3-岩藻糖基化以及其催化合成的LeY寡糖在胚胎植入过程中的作用机制。本论文研究将有助于探讨α1,3-岩藻糖基化对胚胎滋养层细胞生物学功能的作用,发现潜在的生物学标志物用于评估妊娠胚胎功能状态,并为治疗女性胚胎发育引起的不孕症提供客观指标。二、实验方法(一)FUT4表达及LeY寡糖合成促进滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力研究。1.凝集素芯片分析正常早孕和流产妇女绒毛组织中蛋白质糖基化的差异表达情况。2.通过Lectin blot和免疫组织荧光分析早孕和流产妇女绒毛组织中α1,3-岩藻糖基化的表达和定位。通过qPCR分析两种绒毛组织中α1,3-岩藻糖基转移酶(FUT3-7,9-11)的基因表达水平。3.Western blot分析早孕和流产妇女绒毛组织中FUT4的蛋白表达水平。通过Western blot和免疫组织荧光分析两种绒毛组织LeY寡糖的表达和定位。4.通过Lectin blot和Western blot检测早孕和流产妇女血清中α1,3-岩藻糖基化、LeY和FUT4的表达水平。5.通过qPCR和Western blot分析敲低和恢复FUT4后,FUT4基因和蛋白的表达水平。通过Lectin blot分析敲低和恢复FUT4后LTL和LeY的表达情况。6.通过免疫荧光共聚焦分析敲低和恢复FUT4后LeY和FUT4的表达和定位。7.通过人绒毛组织体外移植培养观察FUT4和LeY对绒毛滋养层细胞扩展能力的影响。8.通过流式细胞术、胸腺嘧啶核苷类似物染色(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)()和Western blot检测FUT4对滋养层细胞的增殖能力。通过细胞划痕实验、transewll、明胶酶谱和Western blot检测FUT4对滋养层细胞的迁移和侵袭能力的影响。(二)MEST分子的LeY寡糖介导MEST与翻译抑制因子(Eukaryotic translation initiation factor 4E type 2,eIF4E2)的结合,启动胚胎植入相关基因的翻译1.蛋白质谱和GEO数据库(GSE76862)筛选LeY修饰的糖蛋白。2.通过qPCR、Western blot和细胞免疫荧光分析瞬时转染MEST cDNA和MEST mut后,MEST的基因和蛋白表达。3.免疫共沉淀(co-IP)实验检测胚胎滋养层细胞瞬时转染MEST cDNA和MEST mut后,MEST分子的LeY和LTL表达,以及瞬时转染FUT4 cDNA和FUT4 siRNA后,MEST分子的LeY和LTL变化。4.通过流式细胞术、EdU和Western blot分析瞬时转染MEST cDNA和MEST mut后胚胎滋养层细胞的增殖能力。通过transwell、细胞划痕、明胶酶谱和Western blot分析瞬时转染MEST cDNA和MEST mut后胚胎滋养层细胞的迁移和侵袭能力的变化。5.通过蛋白质谱和生物信息学寻找与MEST的互作的蛋白质分子。通过co-IP、免疫荧光分析MEST分子的LeY修饰对MEST与eIF4E2结合的影响。6.通过RNA免疫沉淀与高通量测序结合技术(RIP-seq)获取并分析瞬时转染FUT4 cDNA 和 FUT4 siRNA 后,与 eIF4E2 结合的 mRNA。R语言分析 eIF4E2与mRNA的结合位置和功能分类。7.通过co-IP分析瞬时转染MEST cDNA和MEST mut以及FUT4 cDNA和FUT4 siRNA 后 eIF4E2 对 4E-T 和 GIGYF2 的募集能力。8.通过核糖体分离实验分析瞬时转染FUT4 cDNA和FUT4 siRNA后基因翻译的效率。通过qPCR分析核糖体分离的样品,检测7个基因的mRNA表达情况。9.在体外培养的胚胎中,通过qPCR、Western blot和免疫荧光检测敲低FUT4后FUT4的基因和蛋白表达。通过Lectin blot和免疫荧光检测敲低FUT4后LeY和LTL的表达。通过假孕鼠模型分析FUT4和LeY对胚胎着床率的影响。(三)表皮调节素促进α1,3-岩藻糖基化影响胚胎滋养层细胞合体化和自噬激活1.免疫组织荧光染色、qPCR和Western blot分析正常早孕妇女和流产患者绒毛组织中滋养层细胞合体化和自噬激活情况。2.Western blot和MDC染色检测自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin)和自噬抑制剂(3-MA)处理后滋养层合体化和自噬激活的情况。3.通过qPCR、Western blot和细胞免疫荧光检测不同浓度表皮调节素处理滋养层细胞后FUT4的基因和蛋白表达。Lectin blot检测α1,3-岩藻糖基化的表达。4.Western blot、细胞免疫荧光、MDC和Lyso-tracker检测FUT4对滋养层合体化、自噬水平和自噬溶酶体形成的影响。5.Western blot、细胞免疫荧光、MDC和Lyso-tracker检测表皮调节素恢复FUT4 siRNA对滋养层合体化和自噬的影响。三、结果(一)FUT4催化合成LeY寡糖促进滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力1.与正常妊娠妇女相比流产患者绒毛组织和血清中FUT4、α1,3-岩藻糖基化和LeY寡糖的表达和合成降低。2.FUT4调控α1,3-岩藻糖基化和LeY的合成。3.下调FUT4抑制胚胎滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力。4.下调FUT4抑制人绒毛组织体外移植体中滋养层细胞扩展能力。(二)MEST分子LeY寡糖修饰介导与eIF4E2的结合,启动胚胎植入相关基因的翻译1.MEST具有α1,3-岩藻糖基化和LeY寡糖修饰。2.MEST糖基化位点突变抑制胚胎滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3.MEST分子α1,3-岩藻糖基化修饰促进与eIF4E2的结合,并促进胚胎植入相关基因的翻译。4.FUT4可以增强胚胎植入相关基因的翻译。5.敲低小鼠胚胎中FUT4的表达和抗体封闭LeY抑制小鼠胚胎植入能力。(三)表皮调节素促进α1,3-岩藻糖基化影响胚胎滋养层细胞合体化和自噬激活1.表皮调节素促进FUT4和α1,3-岩藻糖基化的表达。2.FUT4促进滋养层合体化和自噬激活。3.在滋养层合体化期间FUT4siRNA可以抑制自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin)处理后的自噬激活,FUT4 cDNA可以促进自噬抑制剂(3-MA)处理后的自噬激活。4.表皮调节素可以恢复FUT4 siRNA对滋养层细胞合体化和自噬的抑制作用。四、结论(一)FUT4催化合成LeY寡糖促进滋养层细胞的增值、迁移和侵袭能力1.流产妇女患者的绒毛组织和血清中FUT4、LTL和LeY的表达含量降低。2.FUT4调控α1,3-岩藻糖基化的合成,促进胚胎滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(二)MEST分子的LeY寡糖修饰介导与eIF4E2的结合,启动胚胎植入相关基因的翻译1.MEST分子LeY寡糖修饰调节胚胎滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2.MEST分子LeY寡糖修饰促进与eIF4E2的结合,调控胚胎植入相关基因的翻译。3.小鼠胚胎中FUT4表达降低和减少LeY合成抑制小鼠胚胎植入能力。(三)表皮调节素促进α1,3-岩藻糖基化影响胚胎滋养层细胞合体化和自噬激活1.流产绒毛组织中滋养层合体化与自噬水平均降低。2.表皮调节素促进FUT4和α1,3-岩藻糖基化。3.表皮调节素促进FUT4表达刺激滋养层细胞合体化及自噬激活。