广州管圆线虫病，亦称嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎(eosinophilicmeningitisormeningoencephalitis，EM)，系病原体广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)V期幼虫侵害人的中枢神经系统而引起。本病主要在东南亚、太平洋各岛屿及我国东南沿海流行。2003年广州管圆线虫病被卫生部列为我国新发传染病。目前，广州管圆线虫病的确诊主要靠从病人脑脊液中查到虫体，但检获率很低，约为10％。通常该病的诊断需依靠临床症状、流行病学资料和免疫诊断。因此，建立有效的免疫诊断方法对于该病的防治有极其重要的意义。本课题旨在通过构建广州管圆线虫V期幼虫的cDNA文库，为获取广州管圆线虫期特异性的免疫抗原，建立敏感高效的免疫检测手段和分子生物学技术提供材料来源。 研究目的： 本课题通过对温州及周边地区福寿螺采集和建立广州管圆线虫病的动物模型入手，首先对温州及周边地区进行了广州管圆线虫疫源地的分级，为广州管圆线虫的流行病学调查提供了理论依据。再者，通过感染的动物模型获取V期幼虫，构建高质量的cDNA文库，为进一步研究广州管圆线虫病，寻找特异性的诊断抗原，提高广州管圆线虫病的诊断技术，建立有效的免疫检测或分子生物学检测手段奠定基础。 实验方法： 一、广州管圆线虫中间宿主(福寿螺)的采集及疫源地的分级 在温州市及周边地区，选择近居民区，尤其是垃圾场附近的水塘、沟渠、草坡等环境，捕捉收集福寿螺。分别用不同的检测方法检测福寿螺体内的Ⅲ期幼虫，比较各种方法的优缺点；并用相对简单有效的检测方法对各个地区按文献的方法进行疫源地的分级。 二、广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库的构建及文库的初步鉴定 1、广州管圆线虫Ⅴ期幼虫总RNA的提取：TRIzol法 2、广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库的构建：参照Clontech公司的SMARTcDNAlibraryconstructionkit操作 3、文库PCR鉴定 结果： 1、从广州管圆线虫的中间宿主福寿螺中分离出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫，其形态符合文献所述： 2、成功建立了3种检测广州管圆线虫中间宿主Ⅲ期幼虫的方法，并对其进行了比较和分析； 3、通过对温州及周边地区疫源地的调查并对各地进行了疫源地的分级，分级显示苍南县为Ⅳ级，永嘉县为Ⅲ级，温州市区为Ⅰ级，基本反映了当地的疫源地水平。 4、成功的建立了广州管圆线虫动物感染模型，并成功获取了广州管圆线虫Ⅴ期，与文献所述的形态相符。 5、广州管圆线虫Ⅴ期幼虫的总RNA的提取完整、无降解、杂质少；0D260/OD280=1.879(OD260=0.0853，0D280=0.0454)，RNA浓度340μg/ml。 6、成功构建一个高质量的广州管圆线虫V期幼虫cDNA文库：未扩增文库滴度8.49×10～6fu/ml，重组效率达99.8％，扩增文库滴度5×109pfu/ml。 结论： 本实验比较了检测广州管圆线虫中间宿主的各种方法，进行了初步的评价；对广州管圆线虫疫源地的调查和分级，为广州管圆线虫的流行病学的调查提供了依据。提取了高质量的Ⅴ期幼虫总RNA，并成功地构建了高质量的广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库，未扩增及扩增文库均达到满意的效果，为下一步寻找广州管圆线虫病的期特异性诊断抗原提供了有效的材料来源，为提高广州管圆线虫病的诊断技术和疗效考核奠定基础。