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光系统Ⅱ(PhotosystemⅡ,PSⅡ)是位于类囊体膜上的多亚基色素蛋白复合物,目前已知大约由20种蛋白亚基构成。PSⅡ的生物发生和组装是核基因和叶绿体基因共同调控下的多步骤协同复杂的过程,有很多核编码因子的参与。目前已知在大多数光合生物中,PSⅡ的核心蛋白D1都是以前体形式pD1(precursorD1)合成的。在高等植物中,pD1的C末端延伸的9个氨基酸必须被剪切后方能完成PSⅡ的组装,行使正常的功能。执行这一剪切加工任务的是一种称为D1C末端加工酶(C-terminalprocessingpeptidaseofD1,CtpA)的蛋白。已知通过Blast及结构域分析发现拟南芥中有三个该酶的同源蛋白,编码基因分别为At3g57680、At4g17740和At5g46390。我们利用反向遗传学的方法筛选到了这三个CtpA同源基因的T-DNA插入突变体,并分别命名为atctpa1、atctpa2和atctpa3。通过利用一系列生理生化和分子生物学方法对它们进行分析后,得到了以下结果:
1.atctpa2突变体叶色泛黄,不能光合自养。在MS培养基上,其生长亦非常缓慢。测序结果显示T-DNA插入在其起始密码子ATG上游的-30~-40之间,造成了基因转录和AtCTPA2蛋白表达水平的严重下调。叶绿体超微结构显示,atctpa2突变体中的基粒和基质片层较之于野生型都有很大程度的减少,且类囊体膜系统比较稀疏,表明叶绿体的发育受到了影响。
2.atctpa2突变体中,PSⅡ的电子传递活性受到了很大程度的影响,PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ的实际量子产量(ΦPSⅡ)以及PSⅡ的电子传递链活性均显著降低。荧光分析表明PSⅡ的供体侧和受体侧损伤严重,Mn簇的结合可能受到了影响。
3.atctpa2突变体中,光合相关蛋白的稳态表达受到了严重的影响。PSⅡ核心蛋白D1、D2、CP43、CP47的表达下降严重,另外,PSⅠ核心蛋白以及其他的一些复合体蛋白也有不同程度的下降。蓝绿温和胶的结果也显示,在atctpa2突变体中,PSⅡ复合体的组分也严重减少,进一步表明了PSⅡ的结构和功能受到了很大的损伤。
4.atctpa2突变体巾,对D1蛋白的稳态表达的检测发现,D1蛋白不但表达量严重下降,而且大部分都足以前体即pD1的形式存在的,这表明该突变体中D1蛋白前体C末端的加工出现了严重的缺陷。
5.atctpa1和atctpa3突变体中,T-DNA分别插入在倒数第二个外显子和起始密码子上游的promoter区。正常生长条件下(120μmolm-2s-1,温度为22℃,光周期12/12h),这两个突变体以及双突变体atctpa13与野生型表型无差异,但是atctpa1突变体以及双突变体atctpa1-3对光抑制的响应曲线类似,与同样一致的野生型和atctpa3突变体相比,前二者PSⅡ活性下降的更快,且光抑制后恢复的也慢,表明AtCTPA1参与了PSⅡ的光损伤修复循环,而AtCTPA3则没有,且这两个蛋白在强光响应方面的功能上可能并没有相关性。
总体而言,AtCTCPA2蛋白很可能是拟南芥中真正起作用的主要的CtpA,AtCTPA1则参与的是强光下的修复循环,而AtCTPA3的真正功能则有待进一步研究。