论文部分内容阅读
小菜蛾是一类为害十字花科蔬菜的重要害虫,目前已成为对所有类型杀虫剂均产生抗性的昆虫之一,每年在我国引起的农业经济损失高达7.7亿美元,目前我国华中地区小菜蛾的Bt抗性倍数已达到250～400倍。本实验室前期研究表明小菜蛾钙粘蛋白（Cadherin,CAD）及碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphatase,ALP）的Cry毒素结合区域片段表达的蛋白显著增强了Cry1Ac的杀虫活性,对小菜蛾生物学及体内酶活性的影响则尚不明确。本研究克隆了小菜蛾Cry毒素结合区域的钙粘蛋白CAD及碱性磷酸酯酶ALP基因片段,将表达产物PxCAD1及PxALP与Cry1Ac毒素进行混合后对3龄小菜蛾幼虫进行饲喂,观察并记录死亡率、存活幼虫生物学特性及体内酶活性变化,初步明确PxCAD1及PxALP在Cry1Ac对小菜蛾毒杀过程中的增效作用。具体研究内容及结果如下:1、克隆获得2种钙粘基因的Cry毒素结合区片段PxCAD1（751 bp）及PxCAD-m（751 bp）,均可编码247个氨基酸,二者存在6处氨基酸差异;获得1种碱性磷酸酯酶基因的Cry毒素结合区片段PxALP（983 bp）,可编码322个氨基酸,该肽段存在2个N-糖基化位点（N-Acetylgalactosamine,Gal NAc）。经原核表达,分别获得上述3个重组蛋白PxCAD1、PxCAD-m及PxALP。2、分别将PxCAD1（PxCAD-m或PxALP）与Cry1Ac的混合蛋白饲喂3龄小菜蛾幼虫,结果发现PxCAD1与PxALP对Cry1Ac毒素有显著的增效作用,试虫死亡率分别提升21.82%和27.91%,但PxCAD-m的增效作用则不显著。3、与对照相比,饲喂PxCAD1（PxCAD-m或PxALP）与Cry1Ac的混合物后:（1）PxCAD1处理组中,小菜蛾幼虫的化蛹率降低,雌、雄成虫寿命和单雌产卵量提高,但差异均不显著;羽化率为48.71%,较对照显著降低26.76%（P<0.05）;卵孵化率为76.47%,较对照显著降低21.39%（P<0.05）。（2）PxCAD-m处理组中,化蛹率及羽化率增加,单雌产卵量降低,但差异均不显著;卵孵化率为62.37%,显著降低29.49%（P<0.05）。（3）PxALP处理组中,化蛹率及羽化率降低,雌成虫寿命及单雌产卵量升高,但差异均不显著。4、饲喂PxCAD1（PxCAD-m或PxALP）与Cry1Ac的混合蛋白后,小菜蛾幼虫体内的解毒酶活性在24h、48h及72h三个时间点的表现如下:（1）羧酸酯酶（Carboxylesterase,Car E）。在PxCAD1及PxALP处理组中,Car E活性均显著高于对照,但在72h处,PxCAD1处理组Car E活性与对照无显著差异。而PxCAD-m处理组在24h与72h处Car E活性均显著低于对照（P<0.05）,在48h处则显著高于对照组（P<0.05）;（2）谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase,GSTs）。在PxCAD1、PxCAD-m及PxALP处理组中,GSTs活性均显著低于对照（P<0.05）;但在72h处,PxALP处理组幼虫体内的GSTs活性则显著高于对照（P<0.05）。表明PxCAD1与Cry1Ac毒素的混合物可诱导试虫体内Car E活性升高,但对GSTs活性具有显著抑制作用;而PxCAD-m与Cry1Ac毒素的混合物对试虫体内Car E及GSTs活性具有一定的抑制作用;PxALP与Cry1Ac毒素的混合物对试虫体内Car E及GSTs活性具有一定的诱导升高作用。5、饲喂PxCAD1（PxCAD-m或PxALP）与Cry1Ac的混合蛋白后,小菜蛾幼虫体内的保护酶在24h、48h及72h三个时间点的表现如下:（1）超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）。在PxCAD1、PxCAD-m及PxALP处理组中,SOD活性在24h处显著高于对照（P<0.05）,在48h及72h处均与对应时间点的对照无显著差异;（2）过氧化氢酶（Catalase,CAT）。在24h处,PxCAD1处理组CAT活性显著高于对照（P<0.05）,PxCAD-m处理组与对照无显著差异,PxALP处理组显著低于对照（P<0.05）。但3个处理组在48h处均显著低于对照（P<0.05）,在72h处则均与对照无显著差异。结果表明,将PxCAD1（PxCAD-m和PxALP）和Cry1Ac混合使用后,随着处理时间的延长,小菜蛾的SOD和CAT活性受到抑制。6、饲喂PxCAD1及PxCAD-m与Cry1Ac毒素的混合物后,小菜蛾幼虫体内的消化酶在24h、48h及72h三个时间点的表现如下:（1）在24h处,PxCAD1处理组幼虫体内总蛋白酶活性显著低于对照（P<0.05）,PxCAD-m处理组与对照之间则无显著差异;而在48h及72h处,处理组中总蛋白酶活性均与对应时间点的对照无显著差异。（2）在24h、48h及72h处,处理组中胰蛋白酶活性均与对应时间点的对照无显著差异。这表明,在处理早期,PxCAD1与Cry1Ac的混合蛋白对试虫体内总蛋白酶活性具有抑制作用。结果表明,PxCAD1及PxALP对Cry1Ac毒素起到了显著的增效作用,小菜蛾幼虫死亡率显著升高。同时取食PxCAD1与Cry1Ac的混合蛋白会导致小菜蛾幼虫的化蛹率下降,羽化率显著降低,PxALP与Cry1Ac的混合物会导致小菜蛾幼虫的化蛹率和羽化率下降,而取食PxCAD1及PxCAD-m与Cry1Ac毒素的混合物会导致卵孵化率显著降低,从而进一步影响了小菜蛾的种群繁殖;取食混合物后,试虫体内的解毒、保护及消化酶也受到不同程度的影响,与对照相比表现出显著升高或降低。本研究对开发高效安全的新型Bt增效剂提供一定的理论基础,也为小菜蛾的综合治理提供了新的依据。