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目的 先天性巨结肠症（HirschsprungsDisease，HD）是小儿外科常见疾病之一，其发病率居先天性消化道畸形第二位，占存活婴儿的1/5000～1/2000。其主要临床表现为胎粪排出延迟，顽固性便秘和腹胀，常并发小肠结肠炎，低位性肠梗阻，严重影响患儿的生活质量甚至危及生命。HD的发病机制至今尚未完全阐明，目前较为一致的观点认为患儿在胚胎期神经发育过程中神经嵴细胞的迁移发生障碍，肠神经发育出现停顿，肠壁肌间神经丛和粘膜下神经丛的神经节细胞缺失，以致受累肠段异常收缩，其近端结肠代偿性扩张与肥厚，形成HD。 前期在国家自然科学基金课题(30772277)的资助下，利用双向凝胶电泳(Two-eimensionalElectrophoresis，2-DE)技术，获得了分辨率较高的HD狭窄段及正常段肠管组织蛋白表达图谱，通过基质辅助激光解吸电离/飞行质谱时间(Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization-TimeofFlightMassSpectrometry,MALDI-TOF-MS)技术，鉴定了39个差异蛋白质点，得到21个阳性结果。其中蓬乱蛋白(Dishevelledprotein，DVL)与HD的发生关系密切。进而本研究选择其中的亚型DVL-1与DVL-3进行研究。 DVL是机体组织细胞中广泛存在的胞浆蛋白，属于信号转导蛋白，具有多功能和进化上高度保守的特点，于1959年由Fahmy等首次在果蝇可存活的Dishevelled(Dsh)突变类型中克隆得到。之后陆续发现DVL广泛存在于生物体中，从低等生物水螅、线虫、爪蟾，到哺乳动物小鼠和人都存在DVL基因。目前在人类已鉴定出3个同源DVL亚基因，分别为DVL-1、DVL-2和DVL-3。研究发现，DVL在调节细胞增殖、细胞自我更新过程、调节胚胎生长发育、肿瘤发生中都具有重要作用。近来，DVL在神经系统及其胚胎发育相关疾病中的作用得到了研究者们越来越多的关注。目前有关DVL在HD中的表达研究国内外尚未见相关报道，本研究的目的是测定DVL-1和DVL-3在HD中的表达情况，并探讨其在HD发生发展中的作用。 实验方法 1、病例标本 本研究经过中国医科大学附属盛京医院医学伦理委员会批准，收集2006年4月至2012年3月经钡灌肠、直肠肛管侧压和术后病理切片证实的散发性HD狭窄段（无神经节细胞段）和正常段（神经节细胞段）肠管组织标本50例，男41例，女9例，年龄0.5～4.5岁，平均1.5岁。 2、实验试剂 DVL-1多克隆抗体（兔抗人，试剂编号:D3570，Sigma-Aldrich(R)Co.）;DVL-3多克隆抗体(兔抗人，试剂编号:3684R-100，BioVisionIncorporated);总RNA提取试剂盒（Promage公司），反转录试剂盒SuperscriptTMⅡRnaseHReverseTranscriptase、SYBRGreenⅠ的PCRMasterMix(TaKaRa);全蛋白提取试剂盒（北京碧云天生物技术有限公司）;免疫组化染色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）;DAB试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。 3、实验方法 利用免疫组织化学染色方法、荧光实时定量PCR(Quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR)和蛋白印迹(WesternBlot)检测50例HD患儿狭窄段（无神经节细胞）和正常段（神经节细胞）肠管组织中DVL-1和DVL-3的表达情况，并对其表达进行定量与比较分析。 结果 1、免疫组化实验结果 DVL-1和DVL-3在HD狭窄段肠管的粘膜层细胞胞浆内呈强阳性反应，呈深棕黄色(++～+++)，而在HD正常段肠壁的粘膜层细胞胞浆内呈阴性或弱阳性反应，无色或淡黄色（-～±）。狭窄段肠管中异常增生的神经纤维组织可被DVL-3染成深黄色，而正常段的神经丛不被DVL-3着色。通过半定量形态测定分析，DVL-1和DVL-3平均阳性表达面积百分率在狭窄段分别为0.2659±0.0065和0.2551±0.0103，正常段分别为0.0461±0.0067和0.0381±0.0082，差异有统计学意义(P＜0.05)。 2、qRT-PCR实验结果 qRT-PCR发现DVL-1在HD狭窄段的相对表达量是正常段的2.06倍，DVL-3在HD狭窄段的相对表达量是正常段的3.12倍。差异有统计学意义（P＜0.05）。 3、WesternBlot实验结果 WesternBlot结果显示，DVL-1在HD狭窄段肠管中蛋白相对含量39.71±4.53，在正常段肠管中蛋白相对含量为15.01±2.66，差异有统计学意义(P＜0.05)。DVL-3在HD狭窄段肠管中蛋白相对含量为53.90±6.79;在正常段肠管中蛋白相对含量为20.13±3.63，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论 DVL-1和DVL-3mRNA与蛋白在HD狭窄段肠管中的表达明显高于正常段肠管中的表达，提示DVL-1和DVL-3可能与HD的发生关系密切，可能在先天性消化道畸形的肠道发育中具有重要作用。