论文部分内容阅读
苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)和苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)是苹果、梨及多种核果类果树上发生普遍的病毒。这两种病毒分别为纤毛病毒属(Trichovirus)和线形病毒属(Capillovirus)的代表种。我国新疆具有独特的地理环境及悠久的果品生产历史,存在大量的具有地方特色的优良果树种质,形成了我国特有的梨品系-新疆梨(Pyrus sinkiangensis)。为明确新疆梨和苹果的病毒侵染状况,本研究采用生物学方法、分子生物学方法对来源于新疆梨和苹果上的ACLSV和ASGV进行了检测和分子特性的研究,取得如下结果：1.从新疆采集库尔勒香梨、新梨7号、砀山酥梨、巴梨和红富士苹果共40份样品,通过叶片汁液摩擦接种草本指示植物昆诺藜(Chenopodium quinoa)。结果显示,有16份样品接种的昆诺藜产生褪绿斑、坏死斑及皱缩等类似病毒病症状。经试管捕捉反转录PCR (Tube Capture RT-PCR)和免疫捕捉反转录PCR(Immuno Capture RT-PCR)对接种昆诺藜进行ACLSV和ASGV检测,结果显示,接种的昆诺藜样品中ACLSV和ASGV为阳性的各有4株和6株。2.以总RNA为模板,采用RT-PCR技术进行ACLSV扩增,共从8个样品中获得预期大小约680 bp的扩增产物,扩增产物经回收及与载体连接后转化大肠杆菌,各取1个阳性克隆进行序列测定,结果表明来自这些样品的克隆片段大小存在一定的差异,为680-703bp,克隆片段包括CP基因3′端的506 nt(占完整CP基因582nt的87%)及3’端非翻译区的部分序列。3.对来源于库尔勒香梨(KI-2)、新梨7号(XI-1)和红富士苹果(API-4)各1个样品的ACLSV PCR产物的阳性克隆进行SSCP分析,选取表现不同SSCP带型的克隆进行测序,序列比对分析的结果显示各分离物的分子变异程度存在差异,其中来自库尔勒香梨分离物KI-2的3个分子变种(KI-2-6、KI-2-17和KI-2-23)差异较大,相似性仅为84.8-85.4%；而来源于新梨7号分离物XI-1的2个分子变种(XI-1-3和XI-1-17)间及来源于红富士苹果分离物API-4的3个分子变种(API-4-4、API-4-21和API-4-34)间的相似性相对较高,分别为99.8%和92.5-99.8%。4.根据所获ACLSV分子变种CP基因核苷酸序列构建系统发育树,结果显示除来自库尔勒香梨的ACLSV-KI-2-6外,本研究所测定的其它7个分子变种的遗传距离相对较近,与我国早期报道的一个库尔勒香梨分离物’kuerle’及日本的一个苹果分离物P205聚为一组；ACLSV-KI-2-6则与我国的苹果分离物ACLSV-C遗传距离较近,与多个核果类果树上所获分离物共聚为另一组。5.3个ACLSV分离物的3′端非翻译区序列变异相对较大,相似性为80.6-100%,其核苷酸序列匹配分析的结果显示,分子变种间在该区域的多个位点存在部分的序列缺失,因此其片段大小表现出一定程度的差异。6.采用RT-PCR技术,从10份新疆梨、2份砂梨及3份云南红梨样品上扩增到预期大小为500 bp的ASGV扩增产物。对扩增产物克隆和测序,序列分析的结果显示,15个ASGV分离物的CP基因核苷酸及其编码的氨基酸序列相似性分别为88.2-100%和95.6-100%。将新疆梨上ASGV分离物与红梨和砂梨上ASGV分离物进行序列分析,结果显示它们核苷酸及其编码的氨基酸序列相似性分别为88.2-99%和95.6-99%,89.8-97.1%和96.9-99.4%。