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糖酵解作为细胞的基本能量代谢途径广泛存在于各类生物中。真核生物的糖酵解一般都在细胞质中进行。然而,有报道发现少数物种如原生生物的动基体类、少数藻类(如硅藻)中糖酵解途径却并非发生在胞质中,而是分别发生在糖酵解体和线粒体中。在处于关键进化地位的单细胞绿藻-衣藻中,其糖酵解途径的亚细胞定位一直存在争议。本文针对衣藻糖酵解途径的亚细胞定位问题开展了如下两方面的研究工作,获得了一些重要结果:
1衣藻糖酵解途径亚细胞定位的实验研究本实验室曾利用生物信息学方法对衣藻糖酵解途径的酶进行了鉴定和定位预测的理论分析,结果发现该途径的前7步主要发生在叶绿体,后3步则主要发生在胞质。据此,本文选取了糖酵解途径中具有代表性的几个酶(PFKa、PFKb、NAD+-GAPDH和TIM)进行了GFP定位实验,以期通过实验验证该结论。结果表明,参与糖酵解途径第3、5、6步反应的酶(分别为PFK、TIM和NAD+-GAPDH)确实定位到叶绿体。本文的研究结果在一定程度上证实了以往的生物信息学理论分析结果--衣藻糖酵解途径的前七步发生在叶绿体中。
2衣藻叶绿体内糖酵解与卡尔文循环二者之间协调机制的研究既然衣藻糖酵解途径发生在叶绿体中,这势必与同样发生在叶绿体中的卡尔文循环途径发生冲突。因为这两个途径有五步反应是逆向重叠的,它们之间是如何协调的呢?为了探讨这一问题,本文开展了如下研究:首先,我们利用生物信息学方法对衣藻全基因组中参与上述五步逆向重叠反应的酶进行了鉴定,并对它们的定位进行了预测。结果发现,第一步有两个定位到叶绿体的PFK催化糖酵解途径的反应,其逆向反应则是由FBP来催化；第四步在叶绿体中有两个利用不同辅酶(NAD+和NADP+)的GAPDH;第二步有两个拷贝的FBA(FBAa和FBAb)定位到叶绿体；而参与第三步与第五步的TIM和PGK仅有一个拷贝且是叶绿体定位。其次,我们对这些参与五步逆向重叠反应且定位到叶绿体的酶进行了real timeRT-PCR实验,得到了它们的转录表达谱。PFK、FBAb和NAD+-GAPDH在整个光照和黑暗中均表达恒定波动不大,但相对于PFK和NAD+-GAPDH,FBAb的表达量却极低;而FBP、FBAa和NADP+-GAPDH在黑暗条件下表达量低且恒定,而进入光照后表达量急剧增长,1小时之后即能达到最高,表明这些酶的表达是受光调节的；PGK的转录表达情况则与FBP、FBAa和NADP+-GAPDH类似,也是光照条件下表达量剧增,说明它也是受光调节的；TIM在光照条件下也是有上调趋势的,只是幅度较小,推测可能与其作为异构酶催化效率高有关。因此我们认为PFK、FBAb和NAD+-GAPDH是专职参与糖酵解途径的,而FBP、FBAa和NADP+-GAPDH是专职催化卡尔文循环反应的,通过光对它们表达的调节而来协调它们各自参与的反应;而TIM和PGK则是两个代谢途径所共有的,它们是通过光照、底物浓度等综合因素来调节它们所参与的反应方向进而达到两个途径之间的协调。
该研究工作不仅对衣藻糖酵解途径的亚细胞定位进行了实验验证,还首次揭示了衣藻同处叶绿体中的糖酵解与卡尔文循环两个途径之间的协调机制。