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自量子点材料问世以来,人们对它研究的脚步从未停止。从材料的制备、表征到应用,一直是大家所探讨的热点。特别是在生命分析领域,对生命物质的分析、检测;对疾病的诊断、治疗都有赖于新型、功能性、可修饰材料的应用。另外,各种检测技术的开发、应用,对于生命物质的快速、高灵敏度、高选择性检测,以及现在越来越受关注的在线、实时、活体检测都具有至关重要的意义。脱氧核糖核酸(DNA)是构成生物遗传功能、维持生物体各种机能正常运行的基本单元。DNA在结构上的任何变动、缺失、差错,都有可能导致遗传信息的改变及各种疾病的发生。因此,对DNA的分离、检测成为医学诊断、药物研制、生物工程等诸多领域研究的热点。特别是在疾病的医疗诊断和治疗之中,对特定DNA序列的分析以及对DNA链中碱基突变的检测日益受到重视。此外,作为DNA研究中的一个分支,自从90年代初提出适配体的概念以来,由于其具有亲合力高、特异性强,靶分子范围广,筛选制备方便,稳定性好等特点,得到了科研工作者的广泛关注,适体的研究工作得到了快速的发展。核酸适体所结合的靶分子包括金属离子、酶、生长因子、抗体、细胞黏附分子、植物凝集素甚至整个细胞,作用范围非常广泛。基于量子点的电化学发光性能和其金属组份,本论文拟从以下几个方面展开工作:
⑴基于QD-ECL的溶菌酶生物传感器。构建了一种基于量子点(QDs)电化学发光(ECL)技术的生物传感器用于对溶菌酶(lysozyme)的检测。首先使溶菌酶通过温育反应固定在结合有溶菌酶适配体探针DNA链的金电极表面,并形成适配体.溶菌酶结合物。未结合溶菌酶的探针DNA链与5-生物素标记的互补DNA低聚核苷酸(cDNA)杂交形成双链DNA低聚核苷酸结构。亲和素标记的量子点通过生物素-亲和素反应与cDNA结合从而固定到修饰电极表面。此生物传感器的电化学发光信号与连接到cDNA上的量子点的数量成正比,并与传感器所结合的目标蛋白成反比。通过电化学阻抗技术(Electrochemical Impedance Spectroscopy,EIS)对修饰电极的自组装步骤进行了表征。实验结果显示在0～100μg/mL的浓度范围内,传感器ECL光强随着溶菌酶浓度的增加而减弱。此外,该传感器具有良好的稳定性。
⑵基于QD-ECL的ATP生物传感器。通过一种新型、简易的方法,构建了基于适配体(Aptamer)的量子点电化学发光(QD-ECL)生物传感器(Aptasensor),用来对生物体内的高能物质5-三磷酸腺苷(ATP)的测量。不同于现有的基于电化学、荧光或其他方法的适配体传感器的制备方法,这里提到的方法本质上是基于适配体-ATP特异性结合和Watson-Crick碱基互补配对原则。将硫醇修饰的ATP探针DNA链固定在于处理过的金电极后,将电极置于ATP溶液中温育结合,以形成适配体-ATP生物亲和复合物。互补DNA(cDNA)低聚核苷酸则与未结合的探针链进行杂交反应。最后,由于生物素修饰的cDNA的存在,亲和素修饰的QDs通过生物素-亲和素反应与适配体传感器结合。适配体传感器的ECL信号跟结合到cDNA低聚核苷酸的QDs的数量成正比,并与结合的目标分析物ATP成反比。适配体传感器的制备过程用电化学阻抗谱(EIS)和循环伏安(CV)检测。研究了各种实验条件,比如电解液的pH值、温育结合时间和共反应物K2S2O8浓度等,对适配体传感器ECL响应可能存在的影响。适配体传感器的ECL强度随着ATP浓度在0.01～50μg/mL范围内呈线性关系。另外,适配体传感器显示了针对目标分析物良好的选择性和稳定性。这一研究将为扩展QDs-ECL在适配体传感器领域的应用提供了一种新的相对普遍的方法。
⑶基于QD-ECL的凝血酶生物传感器。构建了一种利用量子点电化学发光(ECL)技术检测凝血酶的新型生物传感器。首先将巯基修饰的适配体(15个碱基)probeⅠ固定在金电极上,然后引入凝血酶形成适配体-凝血酶的生物结合物。5端生物素标记的适配体(29个碱基)probeⅡ与凝血酶结合形成三明治夹心结构。亲和素标记的量子点通过生物素-亲和素反应结合到probeⅡ上,结合的量子点间接与凝血酶的量成正比。传感器的ECL强度在0～20μg/mL范围内随着凝血酶浓度的增加而增加。该生物传感器对目标分析物表现出优越的选择性和良好的稳定性。
⑷基于QD的DNA生物传感器。利用生物素-亲和素反应将量子点耦联到修饰电极上而构建了一种DNA生物传感器。通过电化学发光(ECL)和微分脉冲阳极溶出伏安(DifferentiatingPulse Anodic Stripping Voltammetry,DPASV)两种技术测定DNA杂交反应(hybridization)。首先通过Au-S键将探针DNA链固载到预先处理过的金电极表面,用巯基己醇(MCH)封闭金电极表面的其他活性位点。将目标DNA链溶液滴加到修饰有探针链的电极上进行温育,使探针链和目标链进行碱基互补杂交反应。最后通过亲和素-生物素反应将亲和素修饰的量子点结合到生物素修饰的目标DNA链上。结合到修饰电极上的量子点的数量与目标DNA链正成比。整个自组装过程使用电化学交流阻抗(EIS)和循环伏安(CV)进行表征。