【摘 要】
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枯草芽孢杆菌（Bacillus subtills）目前是科学界研究最深入的革兰氏阳性细菌,它是研究代谢,蛋白质分泌等方面的理想模型菌株。B.subtills被认为是在工业和制药应用中的安全细菌,已被开发成为强大的工具,用于高产各种高附加值的精细化学品和一系列工业酶制剂。碱性蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类,广泛应用于清洁、食品、医疗等行业。但其在国内存在菌种单一、作用范围窄、性能不足等问题,因
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枯草芽孢杆菌（Bacillus subtills）目前是科学界研究最深入的革兰氏阳性细菌,它是研究代谢,蛋白质分泌等方面的理想模型菌株。B.subtills被认为是在工业和制药应用中的安全细菌,已被开发成为强大的工具,用于高产各种高附加值的精细化学品和一系列工业酶制剂。碱性蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类,广泛应用于清洁、食品、医疗等行业。但其在国内存在菌种单一、作用范围窄、性能不足等问题,因此需要挖掘碱性蛋白酶的新特性。近期研究发现碱性蛋白酶在生产生物活性肽方面有巨大潜力,这将进一步拓宽其在保健食品领域中的应用。本研究利用枯草芽孢杆菌异源表达地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）来源的碱性蛋白酶Sub C。通过筛选3种枯草芽孢杆菌宿主菌株（B.subtilis 1A751,MA07,MA08）和6种信号肽（Amy E,Apr E,Npr E,Pel,Ydd T,Yoq M）,同时优化诱导剂浓度、发酵培养基和发酵时长,最终得到最优重组菌株MA08-Amy E-sub Copt。重组菌株MA08-Amy E-sub Copt其胞外酶活力为3.33×10~3AU/m L,胞外蛋白分泌量为胞内可溶蛋白表达量的4倍,与携带野生型信号肽的对照组菌株WT相比,酶活提高了73.4%。异源碱性蛋白酶Sub C在枯草芽孢杆菌中成功表达,为碱性蛋白酶Sub C的表达和在保健食品领域工业化应用提供了理论基础。紫色杆菌素（violacein）具有抗菌、免疫调节等生物活性。由于其天然生产菌株生产率低下且具有潜在的条件致病性,因此需要寻找新的模型宿主菌株。本研究首次利用革兰氏阳性菌株枯草芽孢杆菌异源表达紫色杆菌素。通过将枯草芽孢杆菌强RBS序列引入紫色杆菌素生物合成途径中的5个功能基因vio ABCDE的起始密码子前,构建了诱导型紫色杆菌素表达载体p MATE-vio,初步实现异源表达。进一步对紫色杆菌素代谢途径中的关键基因trp操纵子进行过表达,同时对发酵培养基和诱导时间进行优化,最终得到重组菌株TRAP-1A751-vio。重组菌株TRAP-1A751-vio最终紫色杆菌素产量达到1053.71 mg/L。
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