论文部分内容阅读
胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）在全世界范围广泛分布，给养猪业造成了巨大的经济损失，由于各个国家及地区流行的优势血清型不相同，且该病原菌已经发现的15个血清型表现非常大的致病性与免疫原性差异，灭活疫苗不同血清型之间的交叉保护能力很弱，至今仍没有能提供完全保护的疫苗上市，给该病的防治带来很大困难。近来在病原菌新发现一种非菌毛粘附素—三聚体自转运粘附素（Trimericautotransporter adhesins，TAAs），该家族蛋白广泛介导细菌对宿主的粘附与侵袭，促使细菌逃避吞噬及补体杀灭等多种生物学功能，尤其是诸如VtaA，DrsA，NadA等重组的TAAs蛋白可以诱发机体产生特异性免疫应答，产生的抗体能够有效抑制病原体的感染，是潜在的疫苗研究方向。本课题组在前期研究中，发现毒力较强的APP血清5b型L20菌株含有一个三聚体自转运粘附素基因（GenBank：ABN73547.1，命名为Apa1）并且发现该粘附素影响细菌的致病性。通过对APP5b型L20菌株的全基因序列（GenBank：CP000569.1）进一步分析，发现该菌同时含有另一个自转运粘附素基因（GenBank：ABN73212.1），命名为Apa2。采用SignalP3.0，SMART，daTAA，Predicting Antigenic Peptides等软件对Apa2蛋白的结构与功能进行系统的生物信息学分析，预测Apa2为三聚体自转运粘附素家族成员，并将Apa2蛋白N端的162-485aa及656-1070aa的YadA-like head样粘附基序分别命名为Apa2H1，Apa2H2，C末端3045-3154aa的YadA-like-C样锚定部基序命名为Apa2C。采用DNA重组技术原核表达Apa2H1基序，Apa2H2基序及Apa2C基序，分别获得His-Apa2H1重组蛋白，His-Apa2H2重组蛋白，HAT-Apa2C重组蛋白，同时运用正负向筛选标记的两步单交换同源重组方法构建了野生菌株的Apa1/Apa2双基因敲除菌株，即△Apa1/△Apa2菌株，比较△Apa1/△Apa2菌株与野生菌株在体外、体内的生物学特性差异，深入研究TAAs对APP血清5b型L20菌株生物学功能的影响，尤其是TAAs介导的细菌毒力变化。研究发现，His-Apa2H1重组蛋白粘附活性不强，但是对APP5b的保护率为70%，His-Apa2H2重组蛋白可以有效抑制APP5b对RAW264.7细胞和CRL2845细胞的粘附，并且具有良好的免疫原性，对APP5b的保护率为80%，具有成为潜在的疫苗成分的研究价值。HAT-ApaC重组蛋白以三聚化的形式存在，证明Apa2为三聚体自转运粘附素，ApaC区是转运区域。△Apa1/△Apa2菌株相对于野生菌株，体外培养条件下，菌体表面粗糙，细菌壁上有絮状物沉积，生物被膜形成能力降低，自凝能力下降，粘附与侵袭RAW264.7细胞及CRL2845细胞能力降低。动物实验时，本研究成功构建了APP经鼻腔接种进入呼吸道而感染小鼠的模型，采用腹腔接种与鼻腔接种两种方式感染小鼠评价△Apa1/△Apa2菌株的毒力，证实腹腔接种方式下，△Apa1/△Apa2菌株的LD850为2.93×10CFU，鼻腔接种方式下为8.36×107CFU，均高于野生菌株，此外，尽管采用同一接种方式下的相同感染剂量，不同菌株表现出相似的临床症状及肺组织病理学变化，但是△Apa1/△Apa2菌株在小鼠肺脏、脾脏的定殖能力弱于野生菌株。本研究明确了Apa2蛋白的粘附功能域及锚定区的生物学特性，证实Apa1和Apa2是细菌形态、自凝、被膜形成、粘附与侵袭及体内定殖不可缺少的结构。为进一步研究TAAs介导的APP感染机制及预防APP感染提供一种新的研究思路。