一循环miR-429在肝细胞性肝癌早期预警及诊断中的作用和机制研究（一）研究背景和目的：肝细胞性肝癌（HCC）是肝脏最常见的恶性肿瘤，占世界范围内癌症相关死亡的第三位。由于利用现有的肝癌诊断方法大多数肝癌患者被确诊时已为晚期，导致其5年生存率低至10％-15％，所以对癌症发生的早期预测和早期检测对于选择有效的治疗方法来说至关重要。目前使用得最广泛的肝癌筛检方法包括血清甲胎蛋白（AFP）检测和B超等影像学检查等。然而，这些传统的方法都不能用作肝癌早期预测的理想指标。相当多的肝细胞性肝癌病人表现出甲胎蛋白水平低或正常，与之相反，约20％-25％的慢性肝炎、肝硬化及其他肝脏疾病患者具有较高AFP水平。另一方面，虽然改进的成像技术使人们有可能发现肝脏局灶性小病变，但是还很难区分良性病变与肿瘤，并且诊断结果与技术操作人员的经验密切相关，受主观因素影响较大。由于血清甲胎蛋白和影响学检查都不是理想的肝癌预测及检查方法，也就促使我们去发现更加敏感和特异的标志物，以期利用这些可能的方法与传统的检查方法一起对肿瘤高危人群发生HCC的可能性进行监测。miRNAs是一种内源性的、长约22nt的RNA，它通过靶向mRNA导致其降解或翻译抑制而在动、植物中起到重要的调节作用。miRNAs广泛存在于灵长类、啮齿类、鸟类、鱼类、蝇类、蠕虫类、植物、病毒中，从2002年有统计的200多种到2008年底的将近9000种，miRNAs的发现呈现爆发性增长，并且不断有新物种中的miRNAs被发现。人类miRNAs基因仅约占基因总数的2%-3%，但却能调控人体内1/3的蛋白表达，这种转录后调控作用直接影响了这些靶基因的功能，参与了包括消化系统在内的多个系统的生理、病理过程。miRNAs在消化系统中的作用涉及发育、老化、分泌、代谢、病毒感染、免疫反应、肿瘤等等方面，尤其是作为癌基因或者抑癌基因在肿瘤发生发展中的作用显的尤为重要。有研究表明，不同类型的消化系统肿瘤有特定的miRNAs异常表达，和mRNA表达谱的零散不同，miRNAs在特定肿瘤中聚集成簇表达，如miR-192、 miR-194、miR-215在肠源性肿瘤中成簇高表达，因此miRNAs可以作为癌症诊断的工具。很多不同的研究还表明， miRNAs的表达在肝细胞性肝癌中是异常失调的，并且和肿瘤细胞的生长、凋亡、迁移或侵袭有关，这也就提示我们miRNAs也许能够作为肝癌诊断的一种新的方法。最新的一些研究表明，循环miRNAs可以作为理想的血源性新型生物标志物用于肿瘤的早期检测。此外，血清miRNAs的定量被认为可以有力地反映早期肿瘤状况或者极低肿瘤负荷情况。基于以上分析，循环miRNAs被用来作为非侵入性地监督肝癌高危患者的新的分子标记具有理论可行性。本研究主要的研究对象为包含3070个慢性HBsAg-阳性病人的每年进行体检的队列，我们首先收集了其中发生肝癌的患者确诊半年至一年以前的血清，通过筛选出与未发生肝癌者相比差异表达的miRNAs谱，以期得到能够预测病毒性肝炎患者发生肝癌的可能性的循环miRNAs指纹图谱，并进一步探讨这些循环miRNAs的来源、作用方式以及调控机制。（二）实验方法：1.利用低密度芯片筛选在影象学诊断肝癌前约6-12个月的循环小RNA特征。2.利用Taqman探针对筛选出来的循环miRNAs进行大样本单独验证。3.通过ROC曲线评价筛选出来的循环miRNAs对于预测肝癌的特异性、敏感性；通过Logistic回归的方法判断筛选出来的循环miRNAs是否肝癌的独立危险因素，并与AFP进行比较。4.通过Logistic回归方程得到的Cutoff值建立肝癌发生风险的指标，并对该指标的可行性进行验证。5.利用Taqman探针对肝癌细胞系内，细胞培养上清中的相应miRNAs进行定量，以探讨筛选出的循环miRNAs是否肿瘤来源。6.通过磁珠分选出EpCAM+及CD133+的肿瘤细胞，通过对其相应miRNAs的表达检测，分析其是否肿瘤起始细胞来源。7.通过相应miRNAs的过表达以及干扰，验证其对于肿瘤起始细胞特性的影响。8.利用Affymetrix Human U133plus2.0基因芯片，筛选出相应miRNAs的靶基因，通过构建该基因的过表达质粒，探讨该基因的功能。9.通过NOD-SCID老鼠皮下荷瘤实验，体内水平验证相应miRNAs及其靶基因在肝癌发生发展中的作用。10.通过DNA甲基化分析，探讨相应miRNAs的异常表达是否和DNA甲基化有关。（三）结果:1.循环miR-429和miR-193a-3p在影像学及AFP诊断HCC之前即表达异常，提示其可以作为监测HBsAg-阳性病人发生HCC风险的指标。2.循环miR-429和miR-193a-3p在BCLC0期的HCC患者血浆中表达异常，提示其可以作为HCC极早期诊断的标志物。3.循环miR-429和miR-193a-3p是HCC发生的独立危险因素，其特异性、敏感性均优于传统的监测指标AFP。4. miR-429在肝肿瘤起始细胞中高表达，提示循环miR-429可能来源于肝T-ICs，并且，miR-429能够促进肝T-ICs的自我更新、增殖和化疗抵抗。5. miR-429直接靶向抑癌基因RBBP4而调节T-ICs的特征，细胞内过表达RBBP4能够逆转miR-429的作用。6. miR-429通过直接靶向RBBP4而在体内水平促进肿瘤的发生、生长。DEN诱导的肝癌模型中也发现循环miR-429水平的逐步升高。7. miR-200b/200a/429簇上游的CpG岛低甲基化状况是导致肝T-ICs中miR-429高表达的原因。（四）结论：通过队列筛查，本研究首次发现循环miR-429和miR-193a-3p可以作为监测HBsAg-阳性病人发生HCC风险的指标。肝肿瘤起始细胞（T-ICs）来源的miR-429能够在体内和体外水平通过直接靶向抑癌基因RBBP4而促进肝T-ICs的自我更新、增殖和化疗抵抗，并且，我们证实在1p36区域miR-200b/200a/429小RNA簇上游CpG岛低甲基化状况是导致肝T-ICs中miR-429高表达的原因。我们的研究结果提示miR-429是预测HCC发生新的监测指标和治疗靶点。二核因子HMGB1介导非酒精性脂肪肝早期阶段肝实质细胞TLR4信号转导通路的活化（一）研究背景和目的非酒精性脂肪肝（NAFLD）日益成为全世界发病最为广泛的慢性肝病之一，在发达国家更是居于各类肝脏疾病之首。虽然，人们对于非酒精性脂肪肝的研究已逾数十年之久，但其发病机制至今尚未完全明确。在众多相关研究和假说中，Day和James1998年提出的“二次打击学说”是最为公认的理论。另外，胰岛素抵抗、氧化应激和相关炎症信号通路也在NAFLD的发生发展中发挥了重要的协同作用。胰岛素抵抗加速了脂肪的新生和游离脂肪酸的释放，被肝细胞吸收后的脂类物质使得溶酶体通透性增强进而促进了各种促炎因子的表达，加之细胞内产生的氧化应激和肠源性内毒素的释放致使枯否细胞过度激活从而加速了肝脏炎症和肝细胞的损伤，并最终激活肝脏星形细胞导致肝纤维化。尽管很多研究已经证明肝脏细胞内过多的脂肪、星形细胞和枯否细胞参与了非酒精性脂肪肝的发生发展，但对于肝脏实质细胞在这其中发挥的作用却知之甚少。目前，有关NAFLD早期发生的分子机制还不明确，因此缺少能够应用于临床实践、实现早期预防的有效分子标志物，较早期的临床诊断仍然是治疗非酒精性脂肪肝的主要途径。Toll样受体(TLRs)是一类主要识别外源病原信号分子（PAMPs）和内源损伤分子（DAMPs）的跨膜受体。广为人知的核内因子高迁移率组蛋白HMGB1就是能与其结合的一种DAMPs。Toll样受体与配体结合后，能够激活天然免疫应答系统，通过调控炎症反应和组织修复维持细胞内的稳态，在宿主防御系统中发挥重要作用。迄今为止，已经发现了13种Toll受体，其中TLR4受体是首个被报道并且研究最为深入的明星分子。越来越多的证据表明TLR4还参与了肝损伤的病理进程，如肝纤维化，肝脏缺血再灌注，酒精诱导的肝损伤，MCDD（甲硫氨酸和胆碱缺乏性饮食）和果糖诱导的NAFLD。另外有研究报道高脂饮食（HFD）引起的细胞内过多的游离脂肪酸（FFA）能够活化TLR4信号通路，促进2型糖尿病胰岛素耐受。但FFA到底通过什么分子介导了TLR4信号通路而促进HFD诱导的NAFLD，尤其是早期发生时TLR4通路发挥的功能和分子机制至今仍然不甚清楚。本研究旨在建立高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝模型，通过对其早期阶段进行研究，探讨肝实质细胞以及非实质细胞的TLR4信号在NAFLD早期阶段的作用，并进一步研究活化NAFLD早期阶段TLR4信号的配体，以期为NAFLD的早期干预、病情转归提供新的思路。（二）实验方法：1.利用HFD喂养TLR4-wildtype (C57BL/10SNJ), TLR4-knockout (C57BL/10ScNJ),MyD88-knockout, TRIF-knockout和TLR2-knockout的老鼠4周-12周，观察NAFLD早期阶段表现。2.采用实时定量PCR技术检测NAFLD鼠肝TNF-α, IL-6, MCP-1以及MIP-2的表达改变。3. HE染色观察NAFLD鼠肝大体形态改变，免疫组化方法检测NAFLD鼠肝巨噬细胞积聚、P65入核、HMGB1释放等。4.建立骨髓移植小鼠模型，观察骨髓来源非实质细胞在NAFLD早期阶段的作用。5.利用Gadolinium Chloride (GdCl3)清除肝脏Kupffer细胞，观察Kupffer细胞清除对NAFLD早期阶段的影响。6.利用鲎试剂盒检测门静脉血中LPS的水平，利用WESTERN BLOT技术检测血浆中HMGB1的水平。7.利用封闭抗体封闭HMGB1的作用，观察HMGB1封闭对NAFLD炎症反应的影响。8.利用干扰小RNA降低TLR4的表达，观察TLR4表达改变对NAFLD炎症反应的影响。（三）结果：1.在NAFLD早期阶段，TLR4敲除能够缓解HFD造成的肝脏失功能和炎症反应。2. TLR4信号参与了NAFLD早期阶段肝实质细胞NF-κB的活化。3. Kupffer细胞和骨髓来源的非实质细胞的TLR4信号不是NAFLD早期阶段必须的。4. HFD能够诱导TLR4内源性配体HMGB1从TLR4野生型的肝实质细胞中释放。5. HMGB1在体外水平介导FFA诱导的炎症反应，HMGB1的封闭性抗体能够抑制这种反应。6. TLR4/MyD88依赖性的信号通路是HMGB1释放所必须的。（四）结论：通过建立HFD诱导的小鼠NAFLD模型，我们对NAFLD早期阶段的分子及细胞事件进行了研究。我们发现在NAFLD发生的早期阶段，肝实质细胞的TLR4信号起主要作用，骨髓来源的非实质细胞或者肝脏Kupffer细胞的TLR4信号不是早期阶段必须的；我们首次报道在NAFLD早期阶段活化肝实质细胞TLR4信号的是其内源性配体HMGB1而不是外源性配体LPS，通过封闭HMGB1的作用能够缓解FFA引起的炎症反应。本研究加深了对NAFLD早期阶段发病机制的研究，为疾病的早期干预、病情转归提供了新的思路。