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目的:牙周炎对糖尿病的影响的研究鲜有报道,近年研究表明自噬在糖尿病的发生发展中具有重要作用。本研究旨在探索牙周炎优势菌牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)来源的LPS是否通过沉默自噬经典信号通路磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/m TOR)诱导胰岛β细胞发生自噬,促进糖尿病的发展,以此阐明牙周炎促进糖尿病发展的分子机制。方法:本研究采用了小鼠胰岛素瘤βtc6细胞。通过体外培养小鼠胰岛素瘤βtc6细胞,采用不同浓度葡萄糖和LPS单独或联合刺激刺激12h。分别设置对照组(Control组)、LPS组、葡萄糖组(Glu组)和LPS+Glu组;另外,加入自噬抑制剂3MA(5μmol/L)和自噬激活剂雷帕霉素(10mmol/L)(Rapa)对PI3K/AKT/m TOR信号通路进行干预,包括Control组、三个激活组(Rapa+LPS组、Rapa+Glu组、Rapa+LPS+Glu组)和三个抑制组(3MA+LPS组、3MA+Glu组、3MA+LPS+Glu组)。1.(1)CCK-8检测不同刺激对小鼠胰岛素瘤βtc6细胞增殖能力的影响;(2)ELISA试剂盒检测上清液中胰岛素浓度;2.(1)Annexin V-FITC/PI结合流式细胞仪检测各组小鼠胰岛素瘤βtc6细胞胞内活性氧(ROS)聚集量;(2)透射电镜观察自噬小体数量及线粒体形态学变化;(3)RT-PCR和WB方法检测各组小鼠胰岛素瘤βtc6细胞相关指标Becline1、p62,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT,m TOR和p-m TOR表达水平。结果:1.(1)ELISA检测结果显示与Control组相比,葡萄糖浓度为1.38mmol/L、5.50mmol/L、11.00mmol/L时胰岛素分泌量增加(P<0.05),继续增加葡萄糖浓度为50mmol/L时,其胰岛素分泌量与Control组相近,差异无统计学意义(P>0.05);LPS浓度为10μg/ml时,胰岛素分泌量与Control组相近,差异无统计学意义(P>0.05),LPS浓度为20μg/ml、40μg/ml时,胰岛素分泌量较Control组降低(P<0.05)。(2)CCK-8显示,高浓度葡萄糖对小鼠胰岛素瘤βtc6细胞增殖呈抑制趋势,联合LPS刺激则更能显著抑制小鼠胰岛素瘤βtc6细胞增殖。2.(1)Glu组、LPS组和Glu+LPS组胞内ROS聚集量较Control组显著增加,Glu+LPS组较LPS组和Glu组显著增加(P<0.05)。(2)透射电镜观察结果显示,与Control组相比,Glu组、LPS组和Glu+LPS组线粒体结构破坏更严重,同时自噬小体数量增加。(3)与Control组相比,Glu组、LPS组和Glu+LPS组中自噬相关基因LC3Ⅱ和Becline1表达增加(P<0.05),而p62表达趋势则相反(P<0.05)。3.(1)自噬抑制组中,与Control组相比,3MA+Glu组、3MA+LPS组、3MA+Glu+LPS组Becline1蛋白表达显著降低(P<0.05),3MA+Glu+LPS组与3MA+Glu组和3MA+LPS组相比Becline1蛋白表达显著降低(P<0.05);p62蛋白表达则呈相反趋势,且差异具有统计学意义(P<0.05);与Control组相比,3MA+Glu组、3MA+LPS组、3MA+LPS+Glu组中p-PI3K/PI3K比值显著降低(P<0.05),3MA+Glu+LPS组与3MA+Glu组和3MA+LPS组相比p-PI3K/PI3K比值显著降低(P<0.05);与Control组相比,Rapa+Glu组、Rapa+LPS组、Rapa+Glu+LPS组中p-AKT/AKT比值显著降低(P<0.05),p-m TOR/m TOR比值趋势与p-PI3K/PI3K一致(P<0.05)。(2)自噬激活组中,与Control组相比,Rapa+Glu组、Rapa+LPS组、Rapa+Glu+LPS组中Becline1蛋白表达增加,Rapa+Glu+LPS组与Rapa+Glu组和Rapa+LPS组相比Becline1蛋白表达降低(P<0.05);p62蛋白表达趋势与Becline1相反,差异具有统计学意义(P<0.05);p-PI3K/PI3K、p-m TOR/m TOR比值与自噬抑制组相反,p-AKT/AKT比值趋势与自噬抑制组一致(P<0.05)。结论:1、不同微环境可以调节小鼠胰岛素瘤βtc6细胞胰岛素分泌能力;2、LPS能促进ROS聚集,诱导高糖状态下小鼠胰岛素瘤βtc6细胞过度自噬;3、PI3K/AKT/m TOR信号通路可以调控LPS诱导高糖状态下小鼠胰岛素瘤βtc6细胞过度自噬,抑制其胰岛素分泌功能。