微孢子虫（Microsporidia）是一种专性细胞内寄生的单细胞真核微生物。它们在自然界的分布范围十分广泛,几乎能感染包括人在内的所有脊椎动物与无脊椎动物。微孢子虫感染经济昆虫（家蚕、蜜蜂）、水产动物（鱼、虾）,会给养殖业造成重大经济损失。9个属的17种微孢子虫能感染人类特别是免疫缺陷人群。微孢子的生活史一般分为感染期、增殖期和孢子形成期。微孢子虫具有独特的侵染方式,环境刺激下,孢子被激活,其孢壁通透性改变,大量吸收环境重的水分;孢内渗透压改变,极膜层膨胀,产生强大的压力,迫使极管冲破锚定盘,从孢子顶端最薄的极帽处弹出,后极泡膨大,孢原质从孢子内被压迫进入极管并运送进宿主细胞,完成发芽侵染过程。但是发芽的分子机制目前尚不清楚。本实验室在家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）中鉴定了孢壁-锚定盘复合体蛋白NbSWP16,可能与微孢子虫发芽及抗逆相关。NbSWP16与类枯草杆菌蛋白酶Nb SLP1具有相互作用,可能作为Nb SLP1的底物参与极管弹出。鉴于前期研究通过多种表达系统均未获得可溶性表达的NbSWP16蛋白,本研究对该蛋白的可溶性表达进行了探索,并进一步分析了该蛋白的特征,为深入研究NbSWP16的功能奠定了基础。1.家蚕微粒子虫NbSWP16表达特征分析通过生物信息学方法分析了NbSWP16的保守基序及其同源蛋白的保守性,结果表明NbSWP16在微孢子虫进化过程中比较保守,且保守区域主要集中在N端和C端,N端预测到一段保守基序为:PMVLYKNGALAPYDPYTNTSKYAFCVEACPCP,可能具有粘附和连接功能;通过设计特异性引物,采取荧光定量PCR分析表明NbSWP16基因转录主要发生在家蚕微粒子虫的裂殖增殖期。使用NbSWP16抗体通过免疫印迹分析发现,NbSWP16在家蚕微粒子虫感染宿主的2～4天,表达量相对较高,随后表达下调。结合NbSWP16的孢壁定位,推测NbSWP16在裂殖增殖期表达后逐渐堆积于孢壁,参与孢壁形成。2.家蚕微粒子虫NbSWP16可溶蛋白获取及特征分析通过构建pET-DsbA-NbSWP16、pET29-NbSWP16表达载体,转化大肠杆菌表达菌株,成功获得NbSWP16的可溶表达形式;通过Ni柱亲和层析、胶过滤层析、酶切及超滤浓缩等方式,纯化富集了重组可溶蛋白。质谱分析显示Transetta[pET29-NbSWP16]菌株诱导表达后纯化获得的r NbSWP16可与大肠杆菌的脂蛋白形成聚合体。r NbSWP16与商品化枯草杆菌蛋白酶共孵育,免疫印迹分析表明商品化枯草杆菌蛋白酶能将r NbSWP16酶解。3.家蚕微粒子虫NbSWP16功能分析鉴于前述研究表明NbSWP16可能与孢壁糖类及质膜结合稳定孢壁-锚定盘结构。本部分研究分析了NbSWP16的孢壁几丁质及膜脂质结合能力。将纯化的NbSWP16重组可溶蛋白与PIP StripsTM膜孵育,免疫印迹分析表明NbSWP16能与磷脂酸（Phosphatidic acid,PA）结合;热碱处理家蚕微粒子虫成熟孢子,获得脱蛋白几丁质壳,将NbSWP16与家蚕微粒子虫脱蛋白质几丁质壳孵育,免疫印迹及间接免疫荧光结果显示,NbSWP16能够与家蚕微粒子虫脱蛋白几丁质壳结合。鉴于锚定盘及孢壁与极管的紧密结合特征,分析了NbSWP16与极管主要蛋白的互作能力。共转化NbSWP16与极管蛋白Nb PTP1、Nb PTP2和Nb PTP3酵母双杂交载体至酵母感受态细胞,其中NYM32[p GADT7-NbSWP16/p GBKT7-Nb PTP2]共转化菌株可以在SD/-Trp-Leu-His筛选培养基上生长,且使底物变蓝,但不能在SD/-Trp-LeuHis-Ade筛选培养基上生长,说明NbSWP16与Nb PTP2存在较弱相互作用。综上,本研究结果表明NbSWP16在裂殖增殖期转录表达,参与孢壁组装,并可通过连接孢壁几丁质和孢原质膜上的磷脂酸等脂质维持孢壁的稳定,可能在发芽过程中被枯草杆菌蛋白酶降解从而有利于极管弹出。