海豚链球菌诱变发酵法制备透明质酸及其在动物皮肤修复的应用

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目的:获得透明质酸高产的海豚链球菌突变株,并且透明质酸的分子量及纯度也要较高。将透明质酸通过物理及化学方法制成凝胶,探究该类凝胶在动物皮肤修复中的潜在作用。  方法:首先对从罗非鱼中分离的海豚链球菌进行16s rRNA的鉴定,确定为海豚链球菌后进行原始菌株的培养,主要在28℃,摇床培养,150 rpm。对菌体培养后 HA的提取方法为先加入等体积0.1% SDS,再离心得上清,加入2倍体积酒精,4℃静置过夜,再离心得沉淀,即为粗产物,其可用于产物 HA含量的测定,发酵产物经 CTAB法纯化后,用于红外光谱的测定,与标准品比较,确定产物是否为透明质酸。在上述培养条件下测定其生长曲线,取对数期的菌株进行紫外诱变,紫外线的功率为20W,照射距离为30cm,根据在不同时间下的菌体致死率,选择照射时间为35s,该时间下菌体的死亡率在90%以上,未死亡的菌体理论上已经产生突变。然后,筛选突变的菌体,经培养,提取 HA,测定其 HA的含量、纯度及分子量,并与未突变的菌体进行比较,最后筛选留下 HA含量最高的菌株,该菌株在相同的紫外诱变条件下,进行第二次诱变,再筛选HA含量有所提高的菌株,最终留下 HA含量最高的菌株,原始菌株经两次紫外诱变后,其产量有明显的提升。配制葡萄糖培养基与 BHI培养基不同比例混合的培养基,研究菌株在各比例培养基下的生长状况。将 HA通过冷冻解冻的方法及加化学交联剂的方法分别制成凝胶,记为 HAI和 HAII,应用于兔子背部全层皮肤缺损的修复,观察皮肤的修复情况,通过检测动物体内白细胞的量,分析凝胶对动物的炎症的影响。通过测量背部皮肤缺损的恢复情况,分析凝胶对伤口愈合的影响。  结果:得到了 HA高产的海豚链球菌,产量从(82.3±3.3) mg/L增加到(120±10.6) mg/L,增加了46.4%。经提纯后,蛋白质含量从(0.178±0.011) mg/L降低到(0.032±0.017) mg/L,蛋白去除率为82.02%,纯化的效率为88.32%。HA的分子量约为3×105Da,诱变前后变化不大。当 BHI培养基与葡萄糖培养基的比例为7:3时,海豚链球菌的生长状况比单独在 BHI培养基中要好,差异具有显著性,说明一定的葡萄糖培养基对菌的生长有利。两种凝胶(HAI和 HAII)对皮肤伤口的愈合均有一定促进作用,并能减少伤口愈合后瘢痕的形成。在炎症方面,两种凝胶也有降低体内炎症及伤口处炎症的作用。  结论:我们发现了一种新的有望作为透明质酸生产菌的链球菌——海豚链球菌 Streptococcus iniae,经过紫外诱变后获得了一株产量较高的突变株,相比原始菌株其产量提高达46%。物理法和化学法制成的水凝胶后对兔子背部全层皮肤的修复具有明显的促进作用,表现在减轻伤口及全身的炎症反应、减少瘢痕的形成及加速伤口愈合等。
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