“方证相关”是中医辨证论治原理的核心,也是方剂学学理的逻辑基础。方剂的研究不仅要考虑方剂的组成,还应考虑到与其适应的中医病证。本研究在慢性束缚+饮食失节+过度疲劳法的复合方法复制出中医肝郁脾虚证大鼠模型的基础上,以模型动物HPA轴为切入点,比较观察具有疏肝、健脾、疏肝健脾不同功用的柴胡疏肝散、四君子汤、柴疏四君汤对该模型HPA轴的作用异同,并从分子水平上探讨有关方药对模型HPA轴的调节作用机制。论文分为文献综述和实验研究两部分。文献研究部分主要对肝郁脾虚证和柴胡疏肝散、四君子汤、柴疏四君汤的临床与实验研究进展进行了综述。实验研究部分主要从模型动物的表观效应、HPA轴的相关激素变化及中枢受体mRNA水平表达变化等方面进行了探讨。实验方法:将大鼠随机分为正常对照组、肝郁脾虚模型组(以下简称模型组)、柴疏四君汤组、柴胡疏肝散组、四君子汤组共5组,每组10只。后四组动物采用慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节的方法造模,大鼠于每天上午8:00置于束缚盒中限制3h,下午2:00置于盛有温水(22±1℃)的大塑料桶中游泳10min,隔日喂食(隔日禁食,隔日足量给食),连续28d;正常对照组不加任何刺激,自然饲养。于造模第15d,中药各组大鼠分别给予柴疏四君汤4.27g/kg、柴胡疏肝散4.2g/kg、四君子汤4.53g/kg灌胃,1次/d;模型组和对照组分别给予等量蒸馏水,连续14d。观察并记录各组大鼠的情绪行为、毛发色泽、饮食、大小便等外观行为方面的变化;每周测定各组大鼠的体重和体温1次(体温于每周日AM 8:00-8:30测定;体重于每周日PM 2:00-2:30测定)。造模28d后,10%的水合氯醛麻醉动物,腹主动脉取血,分离血浆,采用放射免疫法,待测CRH、ACTH、COR;迅速在冰盘上分离下丘脑及垂体,置于液氮灌中保存,采用RT-PCR方法,测定垂体CRHR、GR,下丘脑ACTHR、GR;部分下丘脑称重后置于煮沸的生理盐水(1ml)中3min,再加1N的冰醋酸0.5ml于匀浆器中匀浆提取,再用1NNaOH 0.5ml中和,低温条件下,3000rpm30min,取上清液,于—20℃保存。采用放射免疫法,测脑中CRH。统计学方法:所得数据均用x±SD表示,多个样本间的组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验;非正态分布资料采用非参数统计分析。全部数据采用SPSS 13.0软件统计处理。实验结果:1.不同方药对模型大鼠外观行为变化的影响:与正常组相比,造模两周时,模型大鼠即表现出活跃程度减弱、情绪不稳定、饮食减少、易醒、便干等变化;造模四周后,模型动物情绪由开始的易怒烦躁的激惹状态转为情绪低落、表情淡漠和争斗减少,饮食减少,大便转为稀溏,毛发变为枯乱发黄,活动渐少,扎堆甚至倦卧等。中药各组给予2周治疗后,柴胡疏肝散组大鼠活跃程度有所增强、情绪状态稳定;四君子汤组大鼠在皮肤毛发、饮食状态、大便状态方面改善明显;柴疏四君汤组大鼠无论在活跃程度、情绪反应,还是在皮肤毛发、饮食、睡眠、大便形态等方面均见较为明显的改善。2.不同方药对模型大鼠体重变化的影响:观察时间范围内正常组大鼠体重逐渐增加,模型组和三个中药组大鼠的体重增加明显缓慢,其中模型组大鼠体重在第四周呈现下降趋势。与正常组相比,模型组、柴胡疏肝散组、四君子汤组、柴疏四君汤组大鼠第1至第4周各点体重均明显降低,差异有显著性意义(P＜0.05)。与模型组相比,连续给药两周后(实验第四周),柴疏四君汤组、柴胡疏肝散组和四君子汤组大鼠体重均呈不同程度增加,其中柴疏四君汤组差异有显著性意义(P＜0.05)。与柴胡疏肝散组相比,柴疏四君汤组和四君子汤组大鼠体重均无明显差异(P＞0.05);柴疏四君汤组和四君子汤组大鼠体重无明显差异(P＞0.05)。3.不同方药对模型大鼠体温变化的影响:观察时间范围内正常组大鼠体温无明显变化,模型组大鼠的体温呈不断降低的变化趋势,三个中药给药组未给药前2周大鼠体温均不断降低,连续给药两周后(实验第3-4周)大鼠体温均呈不断增加趋势。与正常组相比,模型组大鼠于造模第2-4周的各点体温均明显降低,差异有非常显著性意义(P＜0.01);柴胡疏肝散大鼠给药后1-2周的体温仍明显降低,差异有显著性意义(P＜0.05);四君汤组和柴疏四君汤组大鼠体温无明显差异(P＞0.05),其中柴疏四君汤组给药2周后大鼠体温已达正常组水平。与模型组相比,三个中药给药组大鼠体温均呈不同程度升高,差异均有非常显著性意义(P＜0.01)。与柴胡疏肝散相比,柴疏四君汤组大鼠体温明显升高,差异有显著性意义(P＜0.05);四君汤组大鼠体温无明显差异(P＞0.05)。与四君汤组相比,柴疏四君汤组大鼠体温无明显差异(P＞0.05)。4.不同方药对模型大鼠下丘脑组织CRH含量影响:与正常组相比,造模四周的模型组大鼠下丘脑CRH含量明显升高,差异有显著性意义(P＜0.05);三个中药给药组大鼠下丘脑CRH含量差异均无显著性意义(P＞0.05)。与模型组相比,中药各组大鼠下丘脑CRH含量均有不同程度的降低,其中柴疏四君汤组和柴胡疏肝散组降低明显,差异均有非常显著性意义(P＜0.01)。与四君子汤组相比,柴胡疏肝散和柴疏四君汤组大鼠下丘脑CRH含量均降低,差异有显著性意义(P＜0.05)。柴胡疏肝散和柴疏四君汤组间差异无显著性意义(P＞0.05)。5.不同方药对模型大鼠血浆CRH、ACTH、COR含量影响:与正常组相比,模型组大鼠血浆CRH和COR含量明显升高,ACTH含量明显降低,差异均有非常显著性意义(P＜0.01)。与模型组相比,给药二周后,柴胡疏肝散组、四君子汤组、柴疏四君汤组大鼠血浆中CRH含量均有不同程度降低,但差异均无显著性意义(P＞0.05);三组血浆中ACTH含量均有增加,差异均有显著性意义(P＜0.05);三组血浆中COR含量均有不同程度降低,其中柴疏四君汤组差异有显著性意义(P＜0.05)。三个给药组间比较,大鼠血浆CRH、COR和ACTH含量差异均无显著性意义(P＞0.05)。6.不同方药对模型大鼠下丘脑ACTHR、GR mRNA表达水平的含量影响:与正常组相比,模型组和四君子汤组大鼠下丘脑ACTHR和GR mRNA表达均明显降低,差异均有非常显著或显著性意义(P＜0.01或P＜0.05);柴胡疏肝散组下丘脑ACTHR mRNA表达降低,差异有显著性意义(P＜0.05),下丘脑GR mRNA表达水平差异无显著性意义(P＞0.05);柴疏四君汤组大鼠下丘脑ACTHR和GR mRNA表达水平差异均无显著性意义(P＞0.05)。与模型组比较,三个中药给药组大鼠下丘脑ACTHR和GR mRNA表达均有不同程度增加,其中柴疏四君汤组下丘脑ACTHR和GR mRNA表达均明显增加,差异均有非常显著性意义(P＜0.01);柴胡疏肝散组下丘脑GR mRNA表达增加明显,差异有非常显著性意义(P＜0.01),四君子汤组下丘脑ACTHR和GR mRNA表达均无明显差异(P＞0.05)。与柴疏四君汤组相比,柴胡疏肝散组大鼠下丘脑ACTHR mRNA表达降低,差异有显著性意义(P＜0.05);四君子汤组大鼠下丘脑ACTHR和GR mRNA表达均明显降低,差异均有显著性意义(P＜0.05)。与柴胡疏肝散组相比,四君子汤大鼠下丘脑ACTHR mRNA表达下降,差异有显著性意义(P＜0.05),下丘脑GR mRNA表达无明显差异。7.不同方药对模型大鼠垂体CRHR、GR mRNA表达水平的影响:与正常组相比,模型组大鼠垂体CRHR和GR mRNA表达均明显下降,差异均有显著性意义(P＜0.05);柴疏四君汤组垂体CRHR和GR mRNA表达均无明显差异;柴胡疏肝散组和四君子汤组大鼠垂体CRHR mRNA表达均见增加,但差异均无显著性意义(P＞0.05)。与模型组相比,三个中药给药组大鼠垂体CRHR mRNA表达均见不同程度增加,差异均有非常显著或显著性意义(P＜0.01或P＜0.05)。柴胡疏肝散组、四君子汤组、柴疏四君汤三方组间比较,大鼠垂体CRHR和GRmRNA表达差异均无显著性意义(P＞0.05)。结论:慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节法处理大鼠4周可致大鼠出现体温、体重、表观效应群、HPA轴的异常变化;分别给予柴胡疏肝散、四君子汤、柴疏四君汤二周可使模型大鼠的外观表征、体温、体重、HPA轴相关激素的异常变化呈现不同程度的改善;综合评价以柴疏四君汤的干预效果最优。结果表明该模型类似中医的肝郁脾虚证,存在HPA轴调节功能的异常,并伴有交感神经的功能紊乱。最佳干预方柴疏四君汤与该模型具有较高的关联度。这一结果与传统中医的证治经验是一致的。推论:该模型大鼠HPA轴的功能紊乱与其中枢下丘脑ACTHR、GR和垂体CRHR、GR的mRNA表达异常下调有关;柴疏四君汤对HPA轴的中枢调节作用的位点涉及下丘脑和垂体,柴胡疏肝散的作用位点与柴疏四君汤相近,但对下丘脑仅有部分选择性作用,四君子汤的主要作用位点在垂体。本研究为论证“方证相关”提供了一定的客观证据,对深入揭示中医肝郁脾虚证的现代内涵及认识相关方药的效用机制提供了重要的实验依据。