猪在遗传学、生理学、解剖学上和人比较接近,被认为是创制人类疾病动物模型和异种器官移植供体、揭示生殖与发育机制等理想的模式动物,在医学和生物学基础研究方面具有广阔的应用前景。猪胚胎生产操作是推动上述技术造福人类的核心环节。目前,猪胚胎体外生产效率仍不理想,根本原因是对猪胚胎早期发育机制认识不够。MOF (males absent on the first)基因首先发现于果蝇,是果蝇性染色体剂量补偿系统必不可少的成分,在多种真核生物中存在其同源基因。MOF蛋白主要负责特异性催化组蛋白H4第16位赖氨酸残基发生乙酰化(H4K16ac),属于组蛋白乙酰化酶MYST家族,在哺乳动物发育中具有重要作用,然而至今未见猪MOF (pMOF)的相关报道。因此,本研究以猪为研究对象,克隆pMOF并探讨其组织表达谱,然后试图揭示猪胚胎着床前pMOF表达模式及H4K16ac修饰水平的动态变化规律,再通过RNAi技术研究MOF基因对猪胚胎发育的影响及其机制。具体试验及结果如下：试验一：pMOF亚克隆及其编码序列分析。成功克隆出包含完整开放阅读框的(open reading frame, ORF),长度为1471bp的pMOF cDNA,并提交到NCBI基因库(NM 001284366)。基因序列分析结果显示,pMOF位于猪第3号常染色体,其编码区长1377bp,编码458个氨基酸；核苷酸序列上,与人、小鼠编码区的同源性分别为92.88%与88.96%,氨基酸序列上,与人、小鼠的同源性分别为99.34%与98.25%。试验二pMOF的组织表达谱检测。利用实时定量PCR (Real-time quantitative PCR, qPCR)检测了pMOF在猪MII期卵母细胞、精子、颗粒细胞、卵巢、睾丸、心脏、肝、脾、肺、肾、大脑和肌肉中的表达。结果显示,pMOF主要在卵母细胞中表达。试验三：猪着床前胚胎pMOF表达规律及H4K16乙酰化水平变化规律。收集不同发育时期的猪卵母细胞、孤雌激活胚胎,利用经特异性验证的MOF抗体和H4K16ac抗体开展免疫荧光染色,结果显示,在卵母细胞和着床前发育期间,pMOF的mRNA水平呈现持续降低的趋势,但蛋白水平上一直高表达；相应地,H4K16ac从MII期卵母细胞到桑葚胚(Morula)期表达量一直很低,而从早期囊胚期表达开始急剧上升,扩张囊胚期达到最高,孵化囊胚期开始降低。试验四：为验证pMOF是否为母源性基因,我们在猪胚胎基因组激活发生的关键时期,即4-cell期,利用mRNA合成特异性抑制剂——鹅膏蕈碱处理4-cell和8-cell期胚胎,24h后qPCR检测pMOF的mRNA表达。结果发现,在基因组转录受到抑制后,实验组的pMOF表达量和对照组相近,说明在胚胎发生基因组激活后,没有转录生成更多的pMOF,表明pMOF主要来自卵母细胞,极有可能是母源性基因。试验五：为了进一步探明pMOF与H4K16ac之间的功能联系,揭示pMOF对猪着床前胚胎发育的影响及其机制,我们通过在MII期卵母细胞中注射靶向pMOF的siRNA以敲低pMOF的mRNA,并检测对处理后孤雌激活胚胎发育的影响及H4K16ac的变化。结果表明,siRNA干扰后,H4K16ac表达量从4-cell开始显著降低,囊胚期降低得尤其明显；而且,干扰组孤雌囊胚率显著下降,囊胚总细胞数减少,尽管ICM/TE比例无明显变化。此外,干扰组胚胎中与DNA双链损伤修复密切有关的γ-H2AX焦点的比例上升,实验组囊胚后期的萎缩情况要比对照组严重。pMOF的敲低影响孤雌胚胎发育与H4K16ac下调密切相关。综上所述,本研究成功克隆获得pMOF的cDNA;探明了pM卯及其主要靶标H4K16ac在猪孤雌胚胎着床前发育期间的动态表达模式；siRNA干扰结果揭示pMOF可能通过调控H4K16ac修饰水平进而影响孤雌胚胎发育。