Caspase-3抑制剂对兔体外循环心肌保护作用的实验研究

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目的:研究Caspase-3抑制剂对兔体外循环心肌的保护作用,探讨其对体外循环心肌缺血再灌注损伤的作用机制,为临床通过抑制心肌细胞凋亡角度进行心肌保护提供理论和实验依据。方法:模拟临床操作建立兔体外循环模型,将20只健康新西兰大耳白兔随机分为两组。对照组(单纯st.ThomasⅡ停搏液组):常规插管转流,降温至28-30℃时阻断升主动脉,并于其根部注入4℃st.ThomasⅡ停搏液(15ml/kg),心脏表面予冰泥覆盖,15、40分钟后分别再给以半量停搏液顺灌一次。阻断60分钟,复温至37℃时开放升主动脉恢复再灌注,使心脏复跳,再灌注90分钟。实验组(Caspase-3抑制剂组):在上述st.ThomasⅡ停搏液中加入Caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO(1mmol/L),其余操作同对照组。连续监测ECG、Hct、Hb、MAP、SaO2、直肠温度、血气分析等生理指标;应用多导生理记录仪测定左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)及左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax);监测标准肢体Ⅱ导联心电图,记录心肌再灌注时心律失常情况并进行评估;全自动生化检测仪测定CK-MB、LDH血清学水平;高效液相色谱法检测心肌组织ATP含量;透射电镜观察心肌细胞的超微结构及细胞凋亡的形态学改变;原位缺口末端标记法(TUNEL法)检测心肌细胞凋亡:借助Caspase-3活性检测试剂盒,荧光比色法检测心肌细胞Caspase-3蛋白酶活性的变化;采用半定量RT-PCR技术分析心肌细胞Caspase-3mRNA的表达。结果:Hct、Hb、SaO2、血气分析等生理指标组间无显著性差异(p>0.05);实验组于升主动脉开放再灌注后的左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升速率明显高于对照组(p<0.05),左室舒张末压则低于对照组(p<0.05);与对照组相比,实验组在恢复再灌注时心律失常的评分有所下降(P<0.05);CK-MB、LDH血清学水平实验组亦明显低于对照组(p<0.01);心肌组织ATP含量检测显示实验组要优于对照组(p<0.01);正常心肌组织的显微结构表现为肌丝纤维排列整齐,间质无水肿,胞核完整规则,无明显病理改变,对照组的显微改变表现为肌纤维排列紊乱、部分变性,间质明显水肿,炎细胞浸润,细胞界限不清,细胞核不规则,实验组心肌组织病理改变较对照组明显减轻;正常心肌细胞的超微结构表现为细胞结构完整,肌原纤维排列整齐,肌纤维Z带、M线清晰可见,间质无水肿,线粒体饱满、嵴致密,对照组心肌细胞超微结构变化可见肌纤维变细、部分变性、断裂,肌挛缩,问质水肿明显,线粒体肿胀,嵴减少或消失,实验组超微结构损伤则较对照组明显减轻;正常心肌组织中未见或偶见有TUNEL阳性心肌细胞,而在对照组中可见有较多的TUNEL阳性细胞,实验组中TUNEL阳性细胞表达与对照组相比明显减少(p<0.01):再灌注后对照组心肌细胞Caspase-3蛋白酶的活性明显高于实验组(p<0.01);心肌细胞Caspase-3mRNA的表达半定量分析显示,实验组亦明显低于对照组(p<0.01)。结论:(1)体外循环心脏缺血再灌注过程可诱导心肌细胞凋亡。(2)心肌细胞凋亡是影响体外循环心脏术后心功能恢复的重要因素之一。(3)Caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO通过抑制心肌细胞凋亡可以改善心功能,减轻心肌超微结构病理损伤,对体外循环缺血再灌注心肌具有明显的保护作用。(4)Caspase-3抑制剂下调了心肌细胞Caspase-3mRNA的转录与表达及Caspase-3蛋白酶的活性,从而抑制了心肌细胞凋亡,有效减轻了心肌细胞的损伤。
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