目的通过比较正常结肠粘膜、结肠腺瘤(包括管状腺瘤、绒毛状腺瘤、绒毛-管状腺瘤)、腺瘤癌变及结肠癌组织中NF-kB受体激活子RANK及其配体RANKL的表达差异,从而探讨RANK和RANKL在结肠上皮序列转化中的作用及其与肿瘤干细胞的关系。方法采用免疫组织化学S-P法检测结肠上皮序列转化的不同阶段病变中RANK和RANKL表达的差异,分析它们的临床病理意义,探讨两因子结肠上皮序列的转化过程中的作用。检测结肠上皮序列转化的不同阶段病变中CD133、NF-kB的表达情况,同时进行CD31标记计数微血管密度(MVD),比较RANK及RANKL与CD133、CD31、NF-kB表达的相关性,分析CD133、NF-kB因子的表达情况,计数CD31标记的微血管密度(MVD),比较RANK和RANKL与CD133、CD31、NF-kB表达的相关性以及RANK和RANKL的表达与肿瘤干细胞的关系。以40例正常结肠粘膜组织作为对照组,采用Peinado计数方法分析上述几项指标在结肠上皮序列转化的不同阶段病变中的差别和它们之间的相互关系,所得数据经统计学分析并结合随访情况进行评价。结果1.临床病例资料回顾本研究共收集2012年~2014年天津医科大学肿瘤医院存档的结肠腺瘤、腺瘤癌变和结肠癌标本120例以及正常结肠粘膜40例。以上样本均是具有完整的临床病理资料和随访资料,所有标本的患者术前都没有接受放疗或化疗治疗。且明确存档的石蜡包埋组织标本,所有标都采用中性福尔马林固定,经正规石蜡包埋并切片。并由两位具有丰富经验和资质的病理诊断医师按照WHO的《病理组织学分类》复习病理切片对其进行证实。2.在结肠上皮序列转化的不同病变阶段中RANK和RANKL的表达与临床病理意义2.1 RANK在结肠上皮序列转化的不同病变阶段中的表达与临床病理意义RANK的阳性表达产物呈棕黄色,主要表达于结肠癌细胞的细胞膜和细胞浆,呈弥漫性分布。在正常粘膜、结肠腺瘤、腺瘤癌变和结肠癌中RANK的阳性率表达分别为0(0/40)、7.5%(3/40)、70.0%(28/40)和87.5%(35/40),此结果提示RANK在腺瘤癌变及结肠癌组织中的表达明显高于正常粘膜组和结肠腺瘤组,差异具有统计学意义(P<0.05),并且在正常结肠粘膜→结肠腺瘤→腺瘤癌变→结肠腺癌这一序列转化过程中RANK的表达呈逐渐增高趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。在结肠上皮病变转化序列的不同阶段中,RANK与肿瘤的组织学分级和大小密切相关(χ2=152.395,P<0.01;χ2=61.403,P<0.05)。肿瘤级别越高,RANK的阳性表达越强;肿瘤体积越大,RANK的阳性表达越强。RANK的阳性表达与性别和年龄无关(χ2=3.218,P>0.05;χ2=2.114,P>0.05)。2.2 RANKL在结肠上皮序列转化的不同病变阶段中的表达与临床病理意义RANKL的阳性表达产物呈棕黄色,主要表达于结肠癌细胞的细胞膜和细胞浆,呈弥漫性分布。在正常粘膜、结肠腺瘤、腺瘤癌变和结肠癌中RANKL的阳性表达率分别为0(0/40)、10.0%(4/40)、67.5%(27/40)和85.0%(34/40),此结果提示RANKL在腺瘤癌变及结肠癌组织中的表达明显高于正常粘膜组和结肠腺瘤组,差异具有统计学意义(P<0.05),并且在正常结肠粘膜→结肠腺瘤→腺瘤癌变→结肠腺癌这一序列转化过程中RANKL的表达呈逐渐增高趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。RANKL与肿瘤的组织学分级和大小密切相关(χ2=147.436,P<0.01;χ2=61.413,P<0.05)。肿瘤级别越高,RANKL的阳性表达越强;肿瘤体积越大,RANKL的阳性表达越强。RANKL的阳性表达与性别和年龄无关(χ2=3.219,P>0.05;χ2=2.121,P>0.05)。3.在结肠上皮序列转化的不同病变阶段中CD133、NF-k B、CD31的表达与临床病理意义3.1 CD133在结肠上皮序列转化的不同病变阶段中的表达与临床病理意义CD133的阳性细胞产物呈棕黄色,主要定位于结肠上皮细胞的细胞膜和细胞浆,呈弥漫性分布。在正常粘膜、结肠腺瘤、腺瘤癌变和结肠癌中CD133的阳性细胞率分别为10.0%(4/40)、15.0%(6/40)、47.5%(19/40)和57.5%(23/40)。此结果提示CD133在腺瘤癌变及结肠癌组织中的阳性细胞明显多于正常粘膜组和腺瘤组,其差异有统计学意义(P<0.05),并且在正常结肠粘膜→结肠腺瘤→腺瘤癌变→结肠腺癌这一序列转化过程中CD133的阳性细胞呈逐渐增高趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。在结肠上皮转化序列的不同病变阶段中,CD133与肿瘤的组织学分级和大小密切相关(χ2=148.884,P<0.01;χ2=57.472,P<0.05)。肿瘤级别越高,CD133的阳性细胞越多;肿瘤体积越大,CD133的阳性细胞越多。CD133的阳性细胞的多少与性别和年龄无关(χ2=3.473,P>0.05;χ2=2.238,P>0.05)。3.2 NF-kB在结肠上皮序列转化的不同病变阶段中的表达与临床病理意义NF-kB的阳性表达产物呈棕黄色,主要定位于结肠上皮细胞的细胞膜和细胞浆,呈弥漫性分布。在正常粘膜、结肠腺瘤、腺瘤癌变和结肠癌中NF-kB的阳性表达率分别为10.0%(4/40)、12.5%(5/40)、50.0%(20/40)和55.0%(22/40)。此结果提示NF-kB在腺瘤癌变及结肠癌组织中的表达明显高于正常粘膜组和结肠腺瘤组,差异具有统计学意义(P<0.05),并且在正常结肠粘膜→结肠腺瘤→腺瘤癌变→结肠腺癌这一序列转化过程中NF-kB的表达呈逐渐增高趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。在结肠上皮转化序列的不同病变阶段中,NF-kB与肿瘤的组织学分级和大小密切相关(χ2=145.385,P<0.01;χ2=57.472,P<0.05)。肿瘤级别越高,NF-kB的阳性表达越强;肿瘤体积越大,NF-kB的阳性表达越强。NF-kB的阳性表达与性别和年龄无关(χ2=2.786,P>0.05;χ2=2.524,P>0.05)。3.3 CD31在结肠上皮序列转化的不同病变阶段中的表达与临床病理意义CD31的阳性表达呈棕黄色,主要定位于血管内皮细胞,呈弥漫性分布。在正常粘膜、结肠腺瘤、腺瘤癌变和结肠癌中CD31标记的MVD计数分别为0.05±0.22、4.75±1.01、4.90±1.01和5.25±0.98。此结果提示MVD在结肠腺瘤组、腺瘤癌变及结肠癌组织中明显高于正常粘膜组,差异具有统计学意义(P<0.05),并且在正常结肠粘膜→结肠腺瘤→腺瘤癌变→结肠腺癌这一序列转化过程中MVD呈逐渐增高趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。在结肠上皮转化序列的不同病变阶段中,MVD与肿瘤的组织学分级和大小密切相关(χ2=87.436,P<0.01;χ2=66.563,P<0.05)。肿瘤级别越高,MVD逐渐增高;肿瘤体积越大,MVD越高。MVD的高低与性别和年龄无关(χ2=3.473,P>0.05;χ2=2.238,P>0.05)。4.在结肠上皮序列转化的不同病变阶段中RANK、RANKL、CD133、和NF-kB之间的相关性4.1 RANK与RANKL在结肠上皮病变转化序列中表达的相关性通过Spearman等级相关分析,RANK与RANKL的表达在整个结肠上皮序列转化过程中呈正相关(rs=0.652,P<0.01),其中在正常结肠粘膜组织中RANK与RANKL的表达无明显相关性(P>0.05),而在结肠腺瘤组织、腺瘤癌变组织和结肠癌组织中RANK与RANKL的表达呈正相关(rs=0.389,P<0.05;rs=0.568,P<0.05;rs=0.716,P<0.01)。4.2 RANK与CD133在结肠上皮病变转化序列中表达的相关性通过Spearman等级相关分析,RANK与CD133的表达在整个结肠上皮序列转化过程中呈正相关(rs=0.838,P<0.01),其中在正常结肠粘膜组织中RANK与CD133的表达无明显相关性(P>0.05),而在结肠腺瘤组织、腺瘤癌变组织和结肠癌组织中RANK与CD133的表达呈正相关(rs=0.479,P<0.05;rs=0.350,P<0.05;rs=0.605,P<0.01)。4.3 CD133与RANKL在结肠上皮病变转化序列中表达的相关性通过Spearman等级相关分析,RANKL与CD133的表达在整个结肠上皮序列转化过程中呈正相关(rs=0.863,P<0.01),其中在正常结肠粘膜组织中RANKL与CD133的表达无明显相关性(P>0.05),而在结肠腺瘤组织、腺瘤癌变组织和结肠癌组织中RANKL与CD133的表达呈正相关(rs=0.448,P<0.05;rs=0.329,P<0.05;rs=0.588,P<0.01)。4.4 CD133与NF-kB在结肠上皮病变转化序列中表达的相关性通过Spearman等级相关分析,CD133与NF-kB的表达在整个结肠上皮序列转化过程中呈正相关(rs=0.497,P<0.01),其中在正常结肠粘膜组织中CD133与NF-kB的表达无明显相关性(P>0.05),而在结肠腺瘤组织、腺瘤癌变组织和结肠癌组织中CD133与NF-kB的表达呈正相关(rs=0.382,P<0.05;rs=0.324,P<0.05;rs=0.537,P<0.01)。4.5 RANK与NF-kB在结肠上皮病变转化序列中表达的相关性通过Spearman等级相关分析,RANK与NF-kB的表达在整个结肠上皮序列转化过程中呈正相关(rs=0.529,P<0.01),其中在正常结肠粘膜组织中RANK与NF-kB的表达无明显相关性(P>0.05),而在结肠腺瘤组织、腺瘤癌变组织和结肠癌组织中RANK与NF-kB的表达呈正相关(rs=0.412,P<0.05;rs=0.341,P<0.05;rs=0.599,P<0.01)。此结果提示,RANK基因的异常表达与NF-kB上调在整个结肠上皮序列转化的发展过程中可能发挥了一定的作用,RANK基因的异常表达可能参与了调控NF-kB信号转导通路的整个过程。4.6 RANKL与NF-kB在结肠上皮病变转化序列中表达的相关性通过Spearman等级相关分析,RANKL与NF-kB的表达在整个结肠上皮序列转化过程中呈正相关(rs=0.518,P<0.01),其中在正常结肠粘膜组织中RANKL与NF-kB的表达无明显相关性(P>0.05),而在结肠腺瘤组织、腺瘤癌变组织和结肠癌组织中RANKL与NF-kB的表达呈正相关(rs=0.408,P<0.05;rs=0.323,P<0.05;rs=0.590,P<0.01)。此结果提示,RANKL的异常表达与NF-kB上调在整个结肠上皮序列转化的发展过程中可能发挥了一定的作用,RANKL基因的异常表达同样也可能参与了调控NF-kB信号转导通路的整个过程。结论1.RANK基因及其配体表达的上调在整个结肠上皮序列转化的发展过程中可能发挥了一定的作用,RANK基因及其配体的异常表达可能参与了结肠癌的发生发展,并通过促进侵袭参与了肿瘤的演变。2.在整个结肠上皮序列转化过程中,CD133阳性细胞的数量与RANK基因及其配体的阳性表达呈正相关性,即在正常结肠粘膜→结肠腺瘤→腺瘤癌变→结肠腺癌这一序列转化过程中,随着CD133阳性细胞的增多,RANK基因及其配体的阳性表达也增加。提示RANK基因及其配体介导的NF-kB信号转导通路可以激活bcl-2的抗凋亡基因,在结肠腺瘤→腺瘤癌变→结肠癌的转化中抑制肿瘤细胞的凋亡,并且促进了结肠上皮细胞的恶性转化,从而使各因子的阳性表达明显增加;同时,NF-kB信号转导通路通过在基因及蛋白表达两个水平上调控C-IAP的表达,抑制Caspase-8的活化,阻止肿瘤细胞凋亡的发生。此外,NF-kB可通过间接诱导生存因子或直接激活细胞周期蛋白D1的转录来促进细胞G1/S期的进程,从而促进肿瘤细胞的增殖。提示RANK基因及其配体RANKL的表达在结肠上皮转化序列中对结肠上皮肿瘤细胞可能具有特异性,可通过活化NF-kB信号通路从而抑制结肠上皮肿瘤细胞的凋亡,诱导并促进结肠肿瘤的发生。因此,RANK基因及其配体介导的NF-kB信号转导通路的异常可能为结肠癌细胞恶性表型的明显特征之一,并可能为结肠癌形成过程中的早期事件。3.CD133阳性细胞、NF-kB及MVD在结肠上皮序列转化过程的不同病变阶段中依次升高,并且在整个结肠上皮序列转化过程中,RANK和RANKL的表达分别与CD133阳性细胞、NF-kB呈正相关。此结果提示RANK基因及其配体的异常表达与CD133阳性细胞、NF-kB上调在整个结肠上皮序列转化的发展过程中可能发挥了一定的作用,RANK基因及其配体的异常表达可能通过参与调控NF-kB信号转导通路抑制肿瘤干细胞的凋亡,进而使肿瘤发生侵袭。4.对RANK基因及其配体进行观察研究可能成为结肠癌发生机制探讨、高危病例筛选及估测预后的一种新的途径。