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布鲁氏菌病，简称布病，是由布鲁氏菌引起的以流产和发热为特征的一种人畜共患传染病。人感染后常表现为持续性感染，造成多器官的损害,临床表现为持续数日乃至数周发热（包括低热），多汗，肌肉和关节酸痛，乏力，兼或肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等可疑症状及体征。近年来，疫情出现回升势头。控制布鲁氏菌病的主要手段依旧是疫苗免疫。目前人常使用的布鲁氏菌疫苗是104M。该疫苗对人的布病预防起到积极有效作用，但人接种104M后，有较强的副作用，严重影响到布病高危人群对该疫苗使用的积极性。因此，研制一种副作用小、保护力强的新型疫苗势在必行。 本研究以BCG苗为模板扩增出Ag85B的DNA片段，并与pBS-T载体连接，连接产物和pMV261用EcoRI/HindⅢ双酶切，回收产物用T4DNA聚合酶连接得到pMV261-Ag85B载体，同时以羊种布鲁氏菌生物3型05/43株[1]（新疆地区分离的强毒株）为模板，克隆编码bp26和omp25的DNA片段，并与pBS-T载体连接得到pBS-T-bp26和pBS-T-omp25，然后分别用EcoRI/HindⅢ、EcoRI/SalⅠ双酶切pBS-T-bp26、pMV261-Ag85B及pBS-T-omp25、pMV261-Ag85B并回收目的产物，经T4DNA聚合酶连接得到pMV261-Ag85B-bp26和pMV261-Ag85B-omp25。 取重组穿梭质粒pMV261-Ag85B-bp26和pMV261-Ag85B-omp25转化到BCG电感受态细胞，对获得的重组疫苗株进行PCR鉴定；布鲁氏菌bp26重组卡介苗阳性株（rBCG-bp26和rBCG-omp25）液体培养基中摇菌培养，对其菌液进行westernblot检测。用布鲁氏菌M5-90疫苗株、rBCG-bp26和rBCG-omp25和BCG疫苗株分别免疫SPF级BALB/c小鼠，通过流式细胞术检测小鼠外周血中CD4+和CD8+T细胞的含量，纯化BP26和OMP25蛋白为抗原，rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠血清为一抗，利用westernblot重组疫苗免疫动物的血清学检测，免疫小鼠肝脏和脾脏做组织切片HE染色，观察组织病理变化。 本研究主要获得如下结果： 1.经酶切、PCR和DNA测序鉴定:表明所克隆的信号肤Ag85B片段和bp26、omp25片段与文献报道一致，pMV261-Ag85B-bp26、pMV261-Ag85B-omp25，的序列正确，连接方向正确，阅读框与预期一致。成功获得重组疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp25。 2.采用电穿孔技术成功构建rBCG-bp26和rBCG-omp25：以重组菌株为模板，通过PCR扩增得到bp26、omp25的基因片段，westernblot印迹证实rBCG分泌的蛋白能与布鲁氏菌的抗体特异性结合，证实rBCG具有免疫原性。 3.安全性试验结果表明，PBS组、BCG组、rBCG-bp26和rBCG-omp25重组卡介苗组在体征和体重方面无显著差异，说明rBCG-bp26和rBCG-omp25毒副作用小。 4.流式细胞术检测表明，BCG疫苗株、重组卡介苗疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠均可诱导机体产生较强的细胞免疫。 5.Westernblot分析显示纯化的BP26、OMP25蛋白在与重组疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠血清进行反应时，出现了相应的阳性条带，证明重组疫苗株可诱导机体产生相应抗体。 以上结果表明构建的重组疫苗株rBCG-omp25和rBCG-bp26具有良好的疫苗应用前景，同时也为建立用于鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。