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糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoids-induced osteoporosis, GCIP)是糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)通过促进骨吸收、抑制骨形成而引起的骨质疏松。近年来随着糖皮质激素类药物在临床上的大量应用，该病的发病率呈递增趋势，已成为仅次于绝经后和老年性骨质疏松症的第三位骨质疏松症原因，严重威胁着人类的健康。目前，西医防治骨质疏松主要应用钙制剂、VitaminD、二磷酸盐、降钙素及甲状旁腺素等，虽有一定疗效，但存在疗效不稳定、副作用多和吸收差等问题。
作为动物药之首，鹿茸在古籍文献记载中具有“强筋壮骨”的功效，现代药理也证实鹿茸具有抗骨质疏松的作用。本课题组前期工作显示，鹿茸可通过上调Runx2 、ALP等表达，下调RANK信号通路，促进成骨细胞增殖合成，抑制破骨细胞生成分化，并可逆转去势和维A酸所诱导的骨质疏松，但鹿茸胶原酶解物（velevet collagen hydrolysate, VCH)对GCIP的防治作用及分子机制尚未见报道。
本研究基于鹿茸“强筋骨”的传统功效，以VCH作为治疗药物，观察其对地塞米松（dexamethasone, DEX）所致MC3T3-E1细胞损伤和大鼠骨质疏松动物模型的治疗效果，并通过检测Wnt/β-catenin信号转导通路相关蛋白的表达，阐明VCH调节Wnt信号转导通路治疗GCIP的分子机制。为明确VCH抗GCIP的作用提供重要的科学基础和实验依据。
1 VCH的制备及理化性质鉴定
方法：制备梅花鹿茸中段石蜡切片，天狼猩红染色后偏振光显微镜下观察胶原纤维；通过酶解法得到VCH ，采用考马斯亮兰染色、SDS-PAGE凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)等技术，分析VCH的理化性质。
结果：VCH蛋白含量为62.35%，分子量小于20kDa。
2 VCH对DEX所致MC3T3-E1细胞损伤的保护作用及分子机制
（1）VCH对DEX所致MC3T3-E1细胞损伤的保护作用
方法：采用MTT法，检测不同浓度的VCH对DEX损伤MC3T3-E1细胞增殖作用的影响；HE染色观察细胞形态及生长状况；利用Real-time PCR和Western blotting检测ALP和COL I的表达，应用免疫组化法检测BMP-2表达。
结果：各剂量的VCH在24h和48h对MC3T3-E1细胞的增殖均表现出不同程度的促进作用，尤以0.3mg/mL VCH在48h时间点表现出的增殖效应最佳；VCH治疗组大部分细胞形状完整，生长状态较好；VCH可上调ALP、Col I及BMP-2的表达。
（2）VCH对DEX所致MC3T3-E1细胞凋亡的影响及分子机制
方法：通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率；Rodamin 123染色检测线粒体膜电位的变化；Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光检测凋亡蛋白和Wnt信号转导通路相关上下游蛋白的表达。
结果：VCH可明显减少DEX所诱导的MC3T3-1细胞凋亡（p＜0.05）；稳定线粒体膜电位；上调Bcl-2表达，下调caspase 3、caspase 9及p53的表达（p＜0.05）；可下调DDK-1、GSK-3β，上调Dsh和β-catenin表达（p＜0.05），并见β-catenin核转移现象。
3 VCH对GCIP大鼠的保护作用及分子机制
（1）VCH对GCIP大鼠的保护作用
方法：应用im地塞米松制备GCIP大鼠模型，给予VCH治疗 90d 后，检测骨密度、骨重、骨生物力学和骨形态学，采用Real-time PCR，免疫组化，Western blotting和ELISA检测骨代谢、骨形成和骨吸收相关因子。
结果：VCH可增加GCIP大鼠骨密度（p＜0.05），改善骨小梁间距（p＜0.05）；下调TRAP，减少HOP/Cr的代谢（p＜0.05），抑制骨吸收；上调ALP、ColI和BMP-2的表达（p＜0.05），促进骨形成。
（2）VCH对GCIP大鼠骨细胞凋亡的影响及分子机制
方法：应用Western blotting和免疫组化检测凋亡及其信号通路转导相关因子。
结果：VCH可上调Bcl-2的表达，下调caspase 3、caspase 9的表达（p＜0.05），下调骨组织中DDK-1、GSK-3β的表达，上调Dsh和β-catenin的表达；可促进β-catenin的核转移。
VCH主要为分子量小于20kDa的鹿茸I型胶原酶解物。具有抗DEX所致骨质疏松的作用，其分子机制可能是通过靶向抑制分子DKK-1，引起β-catenin含量升高，促进向核转移，有效激活Wnt信号通路，保护细胞凋亡，促进骨形成、抑制骨吸收的双重调节，达到抗GCIP治疗作用。
作为动物药之首，鹿茸在古籍文献记载中具有“强筋壮骨”的功效，现代药理也证实鹿茸具有抗骨质疏松的作用。本课题组前期工作显示，鹿茸可通过上调Runx2 、ALP等表达，下调RANK信号通路，促进成骨细胞增殖合成，抑制破骨细胞生成分化，并可逆转去势和维A酸所诱导的骨质疏松，但鹿茸胶原酶解物（velevet collagen hydrolysate, VCH)对GCIP的防治作用及分子机制尚未见报道。
本研究基于鹿茸“强筋骨”的传统功效，以VCH作为治疗药物，观察其对地塞米松（dexamethasone, DEX）所致MC3T3-E1细胞损伤和大鼠骨质疏松动物模型的治疗效果，并通过检测Wnt/β-catenin信号转导通路相关蛋白的表达，阐明VCH调节Wnt信号转导通路治疗GCIP的分子机制。为明确VCH抗GCIP的作用提供重要的科学基础和实验依据。
1 VCH的制备及理化性质鉴定
方法：制备梅花鹿茸中段石蜡切片，天狼猩红染色后偏振光显微镜下观察胶原纤维；通过酶解法得到VCH ，采用考马斯亮兰染色、SDS-PAGE凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)等技术，分析VCH的理化性质。
结果：VCH蛋白含量为62.35%，分子量小于20kDa。
2 VCH对DEX所致MC3T3-E1细胞损伤的保护作用及分子机制
（1）VCH对DEX所致MC3T3-E1细胞损伤的保护作用
方法：采用MTT法，检测不同浓度的VCH对DEX损伤MC3T3-E1细胞增殖作用的影响；HE染色观察细胞形态及生长状况；利用Real-time PCR和Western blotting检测ALP和COL I的表达，应用免疫组化法检测BMP-2表达。
结果：各剂量的VCH在24h和48h对MC3T3-E1细胞的增殖均表现出不同程度的促进作用，尤以0.3mg/mL VCH在48h时间点表现出的增殖效应最佳；VCH治疗组大部分细胞形状完整，生长状态较好；VCH可上调ALP、Col I及BMP-2的表达。
（2）VCH对DEX所致MC3T3-E1细胞凋亡的影响及分子机制
方法：通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率；Rodamin 123染色检测线粒体膜电位的变化；Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光检测凋亡蛋白和Wnt信号转导通路相关上下游蛋白的表达。
结果：VCH可明显减少DEX所诱导的MC3T3-1细胞凋亡（p＜0.05）；稳定线粒体膜电位；上调Bcl-2表达，下调caspase 3、caspase 9及p53的表达（p＜0.05）；可下调DDK-1、GSK-3β，上调Dsh和β-catenin表达（p＜0.05），并见β-catenin核转移现象。
3 VCH对GCIP大鼠的保护作用及分子机制
（1）VCH对GCIP大鼠的保护作用
方法：应用im地塞米松制备GCIP大鼠模型，给予VCH治疗 90d 后，检测骨密度、骨重、骨生物力学和骨形态学，采用Real-time PCR，免疫组化，Western blotting和ELISA检测骨代谢、骨形成和骨吸收相关因子。
结果：VCH可增加GCIP大鼠骨密度（p＜0.05），改善骨小梁间距（p＜0.05）；下调TRAP，减少HOP/Cr的代谢（p＜0.05），抑制骨吸收；上调ALP、ColI和BMP-2的表达（p＜0.05），促进骨形成。
（2）VCH对GCIP大鼠骨细胞凋亡的影响及分子机制
方法：应用Western blotting和免疫组化检测凋亡及其信号通路转导相关因子。
结果：VCH可上调Bcl-2的表达，下调caspase 3、caspase 9的表达（p＜0.05），下调骨组织中DDK-1、GSK-3β的表达，上调Dsh和β-catenin的表达；可促进β-catenin的核转移。
VCH主要为分子量小于20kDa的鹿茸I型胶原酶解物。具有抗DEX所致骨质疏松的作用，其分子机制可能是通过靶向抑制分子DKK-1，引起β-catenin含量升高，促进向核转移，有效激活Wnt信号通路，保护细胞凋亡，促进骨形成、抑制骨吸收的双重调节，达到抗GCIP治疗作用。