MiR-221-3p介导的c-Fos/beclin-1信号通路在大鼠冠状动脉微栓塞后对心肌细胞自噬的影响

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:besunqz
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目的观察miR-221-3p介导的c-Fos/beclin-1信号通路在大鼠冠状动脉微栓塞(Coronary Microembolization,CME)后对心肌细胞自噬的影响及意义。方法24只Sprague-Dawley(SD)大鼠按照随机数字表法分为假手术组(Sham组)、CME组、CME+miR-221-3p抑制腺相关病毒组(CME+shRNA组)和CME+miR-221-3p空载腺相关病毒组(CME+NC组)(每组各6只)。经左心室心尖注入微栓塞球以构建CME模型;假手术组予以注射等量的生理盐水;其中CME+shRNA和CME+NC组在构建CME模型前4周经大鼠尾静脉分别注射1.1x1011vg载有抑制miR-221-3p以及miR-221-3p空载对照的腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)。各组大鼠建立CME模型术后9小时行心脏超声检测心功能;ELISA法检测血浆肌钙蛋白-I(cTn-I)水平;组织取材做病理切片苏木精伊红(HE)染色评估心肌形态变化及苏木素碱性复红苦味酸(HBFP)染色评估心肌微梗死面积;行透射电镜及免疫荧光等观察心肌自噬情况;逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-221-3p及c-Fos mRNA和Beclin-1 mRNA的相对表达量;蛋白质印迹(Western blot)检测c-Fos、Beclin-1、LC3B及P62等蛋白的相对表达水平;采用SPSS17.0统计软件进行实验数据分析,计量资料采用均数±标准差((?)±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。结果心脏超声检查结果提示,与假手术组相比,CME组左室射血分数(LVEF)显著降低[(90.06±2.03)%和(59.17±5.91)%,P<0.05];与CME组相比,CME+shRNA组的左室射血分数(LVEF)明显增加[(59.17±5.91)%和(78.00±3.98)%,P<0.05]。血浆cTn-I水平检测结果表明,大鼠CME造模术后9小时,与Sham组相比较,CME组[(213.58±21.07)pg/ml vs(30.04±5.47)pg/ml,P<0.05]和CME+NC组[(210.78±19.77)pg/ml vs(30.04±5.47)pg/ml,P<0.05]大鼠血浆cTn-I水平明显增高。而与CME组相比,CME+shRNA组大鼠血浆cTn-I水平显著下降[(98.62±17.67)pg/ml vs(213.58±21.07)pg/ml,P<0.05]。HBFP染色结果表明,Sham组心肌未见明显的微梗死区域,而在CME组、CME+shRNA组及CME+NC组均可见不同区域面积的红色心肌微梗死灶,其中CME+shRNA组心肌微梗死面积较CME组明显减少[(7.59±1.79)%和(15.54±2.75)%,P<0.05]。透射电子显微镜观察结果提示,Sham组大鼠心肌线粒体膜完整,心肌细胞肌原纤维结构清晰,而CME组大鼠心肌肌原纤维碎裂,线粒体肿胀明显,肌丝排列紊乱;与CME组相比,抑制miR-221-3p组可见自噬泡典型的双层膜结构,心肌肌原纤维、线粒体肿胀程度均有减轻。RT-qPCR检测结果表明,经大鼠尾静脉注射载有抑制miR-221-3p及miR-221-3p空载对照的AAV转染4周后,建立CME模型术后9小时,取大鼠心肌组织提取总RNA,进行RT-qPCR检测结果发现,CME+shRNA组AAV载体成功抑制了大鼠心肌组织miR-221-3p表达水平;与Sham组相比,CME组miR-221-3p表达水平明显升高;与CME组相比较,CME+shRNA组miR-221-3p表达水平显著下调,而CME+NC组miR-221-3p未见明显变化。与Sham组比较,CME组c-Fos mRNA与Beclin-1 mRNA表达水平显著下调(均P<0.05);与CME组比较,CME+shRNA组c-Fos mRNA与beclin-1 mRNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(均P<0.05)。Western blot结果提示,通过病毒转染miR-221-3p-shRNA并建立CME模型后检测大鼠心肌组织中自噬相关蛋白LC3B、p62、Beclin-1以及c-Fos/beclin-1通路蛋白表达情况,结果发现,与Sham组相比,CME组大鼠心肌组织中LC3Ⅱ、c-Fos、Beclin-1蛋白表达水平显著下降,同时p62蛋白表达水平显著升高,差异具有统计学意义(均P<0.05)。与CME组或CME+NC组对比,CME+shRNA组大鼠心肌组织中LC3Ⅱ、c-Fos、Beclin-1等蛋白表达水平显著增加,同时p62蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义(均P<0.05)。由此提示抑制miR-221-3p表达后,心肌自噬水平部分恢复,并可能是通过c-Fos/beclin-1信号通路调节CME后诱导的心肌损伤过程。结论本次研究表明,CME后大鼠心肌组织miR-221-3p表达水平上升,同时心肌自噬被抑制,心脏功能明显下降。CME后心肌自噬水平与miR-221-3p表达水平密切相关。抑制miR-221-3p表达,部分可能通过c-Fos/beclin-1信号通路上调心肌自噬,减轻CME后诱导的心肌损伤及改善大鼠心脏功能,为未来CME致心肌损伤的防治研究提供了新的思路和途径。
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