茯苓多糖分离及疫苗佐剂活性评价

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目的:  本研究旨在评价茯苓多糖(PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ)对甲型H1N1流感裂解疫苗和乙肝重组蛋白抗原(HBsAg)的佐剂活性。  方法:  茯苓采用60℃水提、醇沉、透析和冷冻干燥获得茯苓粗多糖(PCP),PCP再经过DEAE-纤维素和Sephadex G-100柱层析,获得分子量均一多糖PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ。凝胶过滤色谱法测定其峰高分子量,毛细管电泳法测定其单糖组成。  茯苓多糖PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ分别联用H1N1流感灭活疫苗或重组乙肝蛋白亚单位(HBsAg),肌内注射免疫小鼠2次,评价其佐剂活性。采用ELISA法测定小鼠血清特异性抗体以及亚类抗体水平,采用MTT法检测脾淋巴细胞的增殖活性,采用流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群百分率。  结果:  (1)PCP-Ⅰ峰高分子量约为2.53×104Da,单糖摩尔比为岩藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.00∶1.75∶0.21∶5.14; PCP-Ⅱ峰高分子量约为2.88×104Da,单糖摩尔比为岩藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.00∶1.45∶0.56∶4.15。  (2)茯苓总多糖中活性多糖成分PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ能显著提高H1N1流感灭活疫苗和乙肝抗原免疫小鼠血清中特异性抗体滴度水平,效果优于铝佐剂  (3)对H1N1疫苗,加入多糖佐剂产生的亚类抗体主要为IgG1和IgM;对乙肝疫苗,加入多糖佐剂产生的亚类抗体主要为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM,效果均优于铝佐剂。  (4)对乙肝疫苗,PCP-Ⅰ在10-200μg/鼠剂量内无明显量-效关系;PCP-Ⅱ在10-200μg/鼠剂量存在明显量-效关系,200μg/鼠剂量最佳。  (5)PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ与HBSAg联用二次免疫后14d-90d期间,均能维持高滴度抗体水平,抗体亚型除IgG1外,还产生IgG2a、IgG2b、IgM和IgG3,佐剂效果优于铝佐剂。  (6)多糖能促进H1N1疫苗和HBsAg免疫小鼠脾脏T和B细胞增殖及B细胞和CTL分化。  结论:  茯苓多糖PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ能提高H1N1流感疫苗和乙肝疫苗免疫小鼠体液免疫和细胞免疫水平,具有显著疫苗佐剂活性。
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