【摘 要】
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多核苷酸激酶/磷酸酶（polynucleotide kinase/phosphatase,PNKP）能催化γ-磷酸基团从核苷三磷酸转移到DNA或RNA的5′羟基末端,导致核酸磷酸化,而核酸磷酸化对DNA损伤修复起关键性作用。噬菌体T4 PNKP是PNKP研究中的典例,也是分子生物学中最常用的酶之一。噬菌体T4 PNKP具有5′激酶和3′磷酸酶活性,分别介导磷酸化和去磷酸化反应,并且反应可同时进行。
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多核苷酸激酶/磷酸酶（polynucleotide kinase/phosphatase,PNKP）能催化γ-磷酸基团从核苷三磷酸转移到DNA或RNA的5′羟基末端,导致核酸磷酸化,而核酸磷酸化对DNA损伤修复起关键性作用。噬菌体T4 PNKP是PNKP研究中的典例,也是分子生物学中最常用的酶之一。噬菌体T4 PNKP具有5′激酶和3′磷酸酶活性,分别介导磷酸化和去磷酸化反应,并且反应可同时进行。关于噬菌体T4 PNKP的研究层出不穷,对其3′磷酸酶单酶的研究也不少,但是对其5′激酶单酶的活性研究却很少见。本文以去除3′磷酸酶活性的噬菌体T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）作为研究对象,对其进行生物信息学分析,并结合分子生物学方法实现T4 PNK的表达、分离与纯化;通过圆二色谱进行构象分析,并检测温度对T4 PNK结构和活性的影响;再利用λ核酸外切酶检测T4 PNK的磷酸化活性;最后借助凝胶滞缓实验和荧光各向异性检测T4 PNK与DNA底物的结合活性。实验结果主要有以下几方面:（1）构建p ET15b-sumo-T4 PNK重组质粒,表达并纯化,获得纯度大于90%的T4 PNK目的蛋白。（2）重组纯化的T4 PNK具有圆二色性,且温度能影响其结构和活性。（3）提纯的T4 PNK具有磷酸化功能。（4）在一定范围内,T4 PNK与结合DNA的量呈正相关关系。（5）适量Na+能增进T4 PNK与DNA的亲和力。（6）T4 PNK对序列较长的核酸底物和ss DNA底物的偏好性较高。综上所述,本文设计序列、构建重组质粒并纯化出T4 PNK目的蛋白,验证了T4 PNK具有磷酸化活性并论证了λ核酸外切酶能消化磷酸化的ss DNA,分析了T4 PNK与其底物之间的亲和力,总结了T4 PNK对核酸底物的偏好性,为DNA磷酸化的生物过程、药物开发等研究提供参考资料。
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