随着我国人口的老龄化及人群生活方式的改变，糖尿病在我国的发病率逐年升高，2010年流行病学研究显示：糖尿病患病人数高达9240万，成为我国重大的公共健康问题。调查显示，糖尿病患者70％以上死于心血管系统疾病，是非糖尿病人群心血管疾病病死率的2～4倍。因此，糖尿病相关的心血管并发症已成为糖尿病患者死亡的主要原因。目前，国内外学者认为糖尿病是心血管疾病的独立危险因素。其中高血糖毒性是损害心脏及血管的主要因素，其造成损伤的程度与高血糖持续时间及血糖的水平密切相关。研究显示，高血糖是导致糖尿病患者心血管损伤最重要的启动因素，长期高糖刺激不仅可导致机体肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS）的激活，活性氧簇（reactive oxygenspecies, ROS）的产生，晚期糖基化终产物（advanced glycation end products, AGEs）及其受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）的增加，还可以激活炎性反应以及内质网应激反应，从而依赖多种途径加速心肌细胞及血管内皮细胞的损伤和死亡。因此，探索高糖损害心肌细胞及血管的新机制，为糖尿病相关心血管并发症的预防和治疗提供新的靶点及措施是目前研究的热点。氯离子通道在全身各脏器及细胞广泛表达。研究显示氯离子通道不仅具有调节心肌细胞容积，维持细胞静息膜电位，调节细胞内pH值，影响细胞增殖与分化等多种生物学功能，还参与了RAAS系统激活和氧化应激、内质网应激、细胞凋亡、炎性反应等重要的细胞病理生理过程。其中氯离子通道与细胞凋亡的关系研究是该领域的热点问题。相关的实验结果发现：在细胞凋亡过程中必然出现细胞的皱缩，这一现象被称之为凋亡性容积减少（apoptotic volume decrease,AVD）。电生理数据显示该过程伴随着钾、氯通道负载的离子外流，氯通道阻断剂能够有效抑制受损细胞凋亡的发生。我们前期的研究发现在通过死亡受体途径、线粒体途径及内质网途径诱导的心肌细胞凋亡模型中，容积敏感外向整流（volume-sensitive outwardly rectifying, VSOR）氯离子通道参与了心肌细胞的损伤过程，阻断其通道可达到保护心肌细胞的作用。那么，在糖尿病中高糖诱发的心肌损伤性机制中是否也有氯离子通道的参与？氯离子通道阻断剂对其影响如何？基于此假设，本实验拟在建立高糖诱导心肌细胞凋亡模型的基础上，通过检测细胞内氯离子浓度、细胞存活率、ROS水平及凋亡相关指标变化探讨氯离子通道对高糖诱导的心肌细胞凋亡的影响及ROS对其调控机制。目的：（1）原代培养乳鼠心肌细胞，构建高糖诱导的凋亡性损伤模型，确定实验高糖的最佳作用浓度及时间。（2）检测细胞内氯离子浓度变化，观察高糖对细胞氯离子通道的影响，探讨氯离子通道阻断剂DIDS对高糖诱导的心肌细胞凋亡的影响。（3）检测高糖对ROS的影响，探讨ROS与氯通道的关系，同时检测氯离子通道阻断剂DIDS对高糖诱导的心肌细胞中ROS水平的影响。方法：（1）原代培养乳鼠心肌细胞及构建高糖损伤模型：常规获取SD大鼠新生乳鼠（0-3d）心肌细胞，应用差速贴壁法纯化心肌细胞，培养48h后进行实验。配制葡萄糖浓度为5.5、11、22、33、44mmol/L的DMEM培养基，分别处理0、24、48、72和96h，摸索高糖损伤的最佳实验条件。（2）实验分组A及检测：分正常对照组、甘露醇组、高糖组、高糖+DIDS组及DIDS组。氯离子荧光探针（MQAE）检测细胞内氯离子浓度的变化，MTT法检测细胞存活率。（3）实验分组B及检测：分正常对照组、高糖组、高糖+DIDS组及DIDS组。流式细胞术及TUNEL凋亡检测试剂盒检测各组心肌细胞凋亡率，蛋白免疫印迹法Western-blot检测凋亡中pro-caspase-3蛋白的表达，Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性，荧光探针（DHE）检测超氧化物阴离子水平。（4）实验分组C及检测：分正常对照组、外源性加入ROS（H2O2）组、高糖组及高糖+N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine, NAC)（ROS清除剂）组，利用氯离子荧光探针MQAE检测各组心肌细胞内氯离子浓度变化。结果：（1）心肌细胞凋亡模型条件：按葡萄糖浓度为5.5、11、22、33、44mmol/L的DMEM培养基分别处理0、24、48、72和96h后，心肌细胞存活率呈浓度及时间依赖性降低，差异有统计学意义（P＜0.05, n=6）。流式细胞术证实高糖诱导的心肌细胞损伤以凋亡形式为主。提示：33mmol/L葡萄糖作用72h，心肌细胞存活率为73.2%±4.1%，以此浓度和时间作为最佳的实验条件。（2）高糖对心肌细胞内氯离子浓度的影响：MQAE检测显示，正常对照组与甘露醇组细胞内氯离子浓度无统计学差异（P＞0.05, n=5）；高糖组与正常对照组比较，细胞内氯离子浓度显著下降（P＜0.05, n=5）；高糖+DIDS组与高糖组比较，细胞内氯离子浓度明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05, n=5）。（3）高糖对心肌细胞存活率的影响：MTT检测显示，正常对照组与甘露醇组心肌细胞存活率无统计学差异（P＞0.05, n=6）；高糖组与正常对照组比较，心肌细胞存活率皆显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05, n=6）；高糖+DIDS组与高糖组相比心肌细胞存活率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05, n=6）。（4） DIDS对高糖诱导的心肌细胞凋亡的影响：流式细胞计数及TUNEL染色检测显示，高糖组与正常对照组相比，细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05, n=5）；高糖+DIDS组与高糖组相比，细胞凋亡率明显减少，具有统计学差异（P＜0.05, n=5）。高糖组与正常对照组相比pro-caspase-3蛋白表达明显减少，具有统计学差异（P＜0.05, n=5）；高糖+DIDS组与高糖组相比pro-caspase-3蛋白表达明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.05, n=5）。高糖组与正常对照组相比Caspase-3活性明显升高，具有统计学差异（P＜0.05,n=5）；高糖+DIDS组与高糖组相比Caspase-3活性明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05, n=5）。（5） ROS对心肌细胞内氯离子浓度的影响：MQAE检测显示，H2O2组和高糖组与正常对照组相比，心肌细胞内氯离子浓度均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05, n=5）。高糖+NAC组中细胞内氯离子浓度相对于高糖组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05, n=5）。（6） DIDS对高糖诱导的心肌细胞内ROS水平的影响：超氧化物荧光探针（DHE）检测显示，高糖组与正常对照组相比，心肌细胞内ROS生成显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05, n=5）；而高糖+DIDS组与高糖组相比，心肌细胞内ROS生成显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05, n=5）。结论：（1）高糖诱导的心肌细胞凋亡过程中伴有细胞内氯离子的外流，氯离子通道阻断剂DIDS可抑制受损心肌细胞内氯离子的外流，维持了细胞内环境的稳态。（2）氯离子通道阻断剂DIDS能明显抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡性死亡，达到保护心肌的作用。（3）高糖刺激产生大量ROS，ROS介导了心肌细胞内氯离子外流；DIDS阻断氯离子通道后，心肌细胞内ROS生成减少，提示ROS与氯离子通道之间可能存在交互调控的作用。