第一部分去泛素化酶USP26通过稳定Snail促进食管鳞状细胞癌转移的机制研究
　　上皮间质转化(EMT)在肿瘤转移过程中发挥着驱动作用，赋予肿瘤细胞更多的间质样特性，更高的浸润性和转移能力。作为EMT过程中关键的调控因子，Snail在肿瘤的发生、发展过程中扮演着重要角色。Snail是一个半衰期较短的蛋白质，翻译后的泛素化修饰是影响其在肿瘤细胞内快速降解的重要因素，因此加强关于Snail泛素化水平调控的研究，对探究肿瘤转移的具体分子机制有着重要意义。近年来，关于去泛素化酶作为逆向调控蛋白质泛素化水平的关键分子，参与肿瘤发生、转移等过程的研究越来越广泛，而关于Snail的去泛素化研究还尚少，于是我们进一步探究了去泛素化酶对Snail蛋白表达的调控作用。
　　在本课题研究中，我们首先利用去泛素化酶文库筛选到了可明显增加Snail蛋白表达的去泛素化酶USP26，并通过免疫共沉淀等实验证明了USP26和Snail间存在相互作用，且Snail羧基端的锌指结构介导了其与USP26的相互作用，USP26催化活性位点所在的USP结构域介导了其与Snail的结合。随后，我们还通过CHX实验、泛素化实验等进一步证明了去泛素化酶USP26可以降低Snail的泛素化水平，增加Snail的蛋白稳定性，并且丧失去泛素化酶活性的USP26突变体不能影响Snail的蛋白稳定性和泛素化水平。我们还通过免疫荧光实验检测了稳定过表达或敲降USP26的食管癌细胞系中EMT标志物的表达水平，发现过表达USP26可明显增加食管癌细胞中间质样标志物N-cadherin和Vimentin的表达水平，抑制上皮样标志物E-cadherin的表达，而在USP26敲降食管癌细胞系中E-cadherin表达上调，N-cadherin和Vimentin表达下调，证明了在食管癌细胞系中USP26可以参与调控EMT过程。通过Transwell实验和体内尾静脉-肺转移模型，我们发现USP26过表达可明显促进食管癌细胞转移，而在USP26过表达的食管癌细胞中同时敲降Snail可逆转USP26对肿瘤细胞迁移和侵袭的促进作用，证明了USP26是通过增加Snail的蛋白表达水平促进食管癌细胞转移。最后，我们通过对食管癌及其配对癌旁组织标本中USP26和Snail蛋白表达水平的检测和分析，我们发现USP26在食管癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，且临床组织标本中USP26和Snail的蛋白表达水平呈明显的正相关性，进一步证明了USP26在食管癌中发挥癌基因的作用，以及USP26对Snail起着正向调控的作用。
　　综上所述，本研究中我们筛选到了一个Snail的去泛素化酶USP26，并证明了在食管癌细胞中USP26可以通过调节Snail的泛素化水平，增加Snail蛋白表达水平，诱导肿瘤细胞发生EMT转变，促进食管癌转移，为食管癌患者尤其是肿瘤转移患者的临床治疗提供了新的潜在靶点。
　　关键词:USP26;Snail;去泛素化;肿瘤转移;上皮间质转化;食管鳞状细胞癌
　　第二部分去泛素化酶OTUD6B通过稳定β-TrCP抑制食管鳞状细胞癌发生的机制研究
　　β-TrCP是F-box蛋白家族成员之一，SCF泛素连接酶复合体的重要组成部分，调控多种蛋白质的泛素-蛋白酶体途径降解，可参与DNA损伤修复、细胞周期、信号转导等多个细胞生物学过程，并在人类肿瘤发生、发展过程中扮演着重要角色。由于靶向底物的多样性，β-TrCP在不同的肿瘤类型和条件下既可以发挥癌基因的作用，又可以具有抑癌基因的功能。β-TrCP作为肿瘤发生发展过程中关键的E3连接酶，其表达水平是受到多方面精密调控的。近年来发现，翻译后的泛素化修饰是调控β-TrCP表达水平的重要途径之一，多个E3泛素连接酶被证实可以参与调控β-TrCP的泛素-蛋白酶体降解，但是关于β-TrCP的去泛素化研究还尚少，于是我们进一步探究了去泛素酶对β-TrCP蛋白表达的调控作用。
　　在本研究中，我们首先利用去泛素化酶文库筛选到了可明显上调β-TrCP蛋白表达水平的去泛素化酶OTUD6B，并通过免疫共沉淀实验、CHX实验、泛素化实验等证明了OTUD6B确实是一个可以和β-TrCP相互结合，并通过降低β-TrCP泛素化水平增加β-TrCP蛋白稳定性的去泛素化酶。在关于食管癌中OTUD6B的具体功能研究中，我们发现OTUD6B可以和Snail相互结合，并通过调控β-TrCP间接影响Snail的蛋白表达水平，且通过免疫荧光实验发现过表达OTUD6B可明显增加食管癌细胞中上皮样标志物E-cadherin的表达，抑制间质样标准物N-cadherin和Vimentin的表达，而β-TrCP表达水平的下调可明显抑制OTUD6B对EMT标志分子的调控作用，证明了OTUD6B可以通过调控β-TrCP间接影响Snail的蛋白表达水平，从而参与调控食管癌细胞的EMT过程。为了明确OTUD6B是否通过调控食管癌细胞的上皮间质转化，最终影响肿瘤细胞的迁移、侵袭能力及干性特征，我们进行了一系列体内外表型实验，发现OTUD6B过表达可明显抑制食管癌细胞的转移及成瘤能力，并可增加肿瘤细胞对化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶的敏感性。此外，OTUD6B还可抑制食管癌细胞中干性标志物SOX、NANOG、OCT4和CK14的表达，上调分化相关基因CK13的蛋白表达。并且在过表达OTUD6B的食管癌细胞中同时敲降β-TrCP可明显逆转OTUD6B对肿瘤细胞转移及干性方面的抑制作用，以及OTUD6B对干性相关基因的表达调控作用，证明了OTUD6B通过上调β-TrCP的蛋白表达抑制了食管癌细胞的转移及干性特征。
　　由于ATRA在多种实体肿瘤中可以诱导肿瘤干细胞分化，降低肿瘤细胞干性，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等，我们也关注了ATRA对食管癌细胞干细胞样特性、转移等表型的影响。我们通过体内外实验证明ATRA处理可明显抑制食管癌细胞的微球体形成、皮下成瘤、侵袭和转移等能力，并且我们还发现ATRA是通过调控OTUD6B的蛋白表达抑制食管癌细胞成瘤和转移的。ATRA可通过抑制RARα与OTUD6B的mRNA结合，降低RARα对OTUD6B的翻译抑制作用，增加OTUD6B的蛋白表达水平。
　　最后，我们通过对食管癌及其配对癌旁组织标本中OTUD6B和β-TrCP蛋白表达水平的检测和分析，发现OTUD6B和β-TrCP在食管癌组织中的表达水平均明显低于癌旁组织，且二者的蛋白表达水平呈明显的正相关性，并且OTUD6B低表达预示着较高的临床分期和较短的生存时间。
　　综上所述，本研究中我们找到了一个以β-TrCP为底物的去泛素化酶OTUD6B，并证明了OTUD6B可通过去泛素化β-TrCP，参与调控食管癌细胞的EMT过程，从而抑制食管癌细胞的转移和干性。此外，我们还证实了ATRA可通过调控OTUD6B蛋白表达抑制食管癌细胞生长和转移，为其应用于食管癌患者的治疗提供了新的理论依据。