【摘 要】
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实验目的:人牙周膜干细胞（Human periodontal ligament stem cells,h PDLSC）是近年来牙周骨组织工程的研究热点。而h PDLSC目前以细胞贴壁二维（two-dimensional,2D）培养技术为主,运用三维（three-dimensional,3D）培养技术形成h PDLSC细胞球体的相关研究较少。3D培养细胞球体作为单细胞的替代品,能够有效改善数量不足和
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实验目的:人牙周膜干细胞（Human periodontal ligament stem cells,h PDLSC）是近年来牙周骨组织工程的研究热点。而h PDLSC目前以细胞贴壁二维（two-dimensional,2D）培养技术为主,运用三维（three-dimensional,3D）培养技术形成h PDLSC细胞球体的相关研究较少。3D培养细胞球体作为单细胞的替代品,能够有效改善数量不足和微环境等问题,成为组织工程的研究趋势。因此,本实验的研究目的是通过制作琼脂糖微孔板构建三维培养条件,探究3D培养下h PDLSC形态、活性的随培养时间的变化规律并通过与2D培养比较以探究3D细胞成球生长条件下对h PDLSC成骨分化的影响。实验方法:1.采用改良酶消化法从人牙周膜中将h PDLSC分离培养,对培养细胞通过细胞表面蛋白CD45、CD73、CD34、CD90和CD105荧光抗体标记后经流式细胞仪进行鉴定;并利用细胞体外成骨、成脂诱导实验结合染色技术检测培养细胞的成骨成脂分化潜能。2.利用琼脂糖浇注聚二甲基硅氧烷母模所制备的微孔培养板,h PDLSC细胞铺入进行3D培养板,显微镜下观察h PDLSC细胞球体随培养时间增长大小形态变化。3.hPDLSC球成骨诱导3、7、10 d后,通过细胞骨架（细胞膜丝状蛋白）荧光标记和细胞核荧光标记检测细胞体在不同时间点的形态变化。4.hPDLSC球成骨诱导3、7、10 d后,通过Live/Dead染色试剂盒检测细胞体在不同时间点的活性变化。5.hPDLSC分别铺入普通6孔板和琼脂糖微孔培养板中,分别建立2D和3D培养条件,测定两种培养条件下测定成骨诱导3 d、7 d后的碱性磷酸酶活性。6.通过RT-qPCR检测hPDLSC在2D和3D培养条件下经成骨诱导后3 d、4 d、7 d基因表达水平,分析与2D培养相比3D培养技术对h PDLSC成骨分化的影响。此外,还检测了β-catenin的基因表达水平。实验结果:1.通过改良酶消化法成功从人牙周膜中将h PDLSC细胞分离培养。流式细胞结果显示细胞表面抗原比例分别为:CD45（0.01%）、CD34（0.15%）、CD105（99.92%）、CD73（99.23%）和CD90（99.1%）,证实细胞为间充质来源。培养细胞经3周成骨诱导、成脂诱导后染色证明具有体外多向分化潜能。2.琼脂糖覆盖在模具后表面获得均匀大小一致的微孔图案,形成琼脂糖微孔培养板。h PDLSC铺入后,5 h内沉降,自我聚集形成一堆细胞;24 h后细胞球体形态开始稳定;24 h-7 d球体形态一直保持稳定。之后随着培养时间增长干细胞球体逐渐缩小。3.细胞球体经骨架染色处理后,细胞膜丝状肌动蛋白染色为绿色,细胞核染色为蓝色。细胞球体细胞骨架染色在7 d内发生变化。与3 d染色相比,10 d染色结果显示微球体紧密,细胞球体绿色染色部分增多,皮层肌动蛋白网络越来越狭窄。4.细胞球体培养3、7、10 d后的Live/Dead染色结果显示,随着培养时间延长,细胞球体核心死细胞逐渐增多。5.成骨诱导3 d后,与2D培养组相比,3D培养组ALP活性显著增强;而成骨诱导7 d后,与2D培养组相比,3D培养组ALP活性减弱。6.RT-qPCR结果显示:经过3 d成骨诱导后,3D培养组与2D培养相比,ALP、OCN表达明显升高;经过4 d成骨诱导后,3D培养组与2D培养相比,Runx2、OCN表达明显升高;经过7 d成骨诱导后,3D培养组与2D培养相比,仅OCN表达明显升高。此外,结果显示成骨诱导3、4、7 d中β-catenin表达均显著升高,且具有时间依赖效应。实验结论:琼脂糖微孔板成功培养h PDLSC球体,细胞球体形态呈时间依赖性变化,随培养时间增长,细胞球直径变小变紧致,球体内部死亡细胞增加;与2D培养组比较,3D培养组前3天ALP活性及3、4、7天部分成骨分化相关基因表达明显升高,提示3D培养技术可促进h PDLSC成骨分化。3D培养后,β-catenin转录水平升高,提示球体变化可能与Wnt/β-catenin通路有关。研究结果建立了h PDLSC球体作为牙周组织中成体干细胞的可能性,为干细胞研究领域提供了新的技术手段。
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