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当今世界,人口老龄化现象日益严重,老年痴呆症患者大量出现。石杉碱甲是治疗老年及早老性痴呆症具有最显著疗效的活性成分之一。它主要来源于药用植物蛇足石杉中,该资源正濒临枯竭。内共生理论认为,内生真菌因与寄主植物长期相互作用,协同进化,可产生与寄主植物相同或相似的次生代谢产物。内生真菌已经成为产活性成分的一个新的重要来源。因此,本文开展对蛇足石杉植株内产石杉碱内生真菌的研究,获得的主要结论如下: 一、通过对新鲜蛇足石杉进行严格的外植体消毒,分离纯化蛇足石杉植株中的内生真菌,测定其ITS序列并进行分子鉴定。得到8株内生真菌菌株L1-L8,隶属于3亚门、4纲、6目、7科、7属、8种,分别为担子菌亚门的金钱菌属金钱菌、裂褶菌属裂褶菌、多孔菌属漏斗多孔菌,子囊菌门的顶囊壳属禾顶囊壳、球腔菌属云南球腔菌和金黄球腔菌及半知菌门的镰刀菌属尖孢镰刀菌、交链孢菌属长柄链格孢等7属的8个菌种。 二、通过对HPLC检测条件进行优化,建立了HPLC检测的最佳条件:[色谱柱:C18柱(250*4.6mm,5.0μm);流动相:甲醇-乙酸铵溶液(37:63,pH5.90-6.05);流速1.0mL/min;柱温25℃;检测波长308nm;进样量20μL]。 三、对蛇足石杉内生真菌8个菌株进行的多重检测和筛选,采用TLC和HPLC。结果发现:两株内生真菌L1和L3菌株产HupA。此外,内生真菌L2、L4菌株可能含有HupA或其类似物,内生真菌L5、L6、L7、L8菌株不产HupA。 四、通过对L1和L3菌株在不同的条件(包括:光照、温度、摇床转速、酸碱度)下其菌株生物量、总生物碱积累的情况进行了研究。结果发现,光照、温度、pH值、摇床转速等均有其最适条件以使产HupA内生真菌L1和L3菌株培养达到最佳的生物量及总生物碱积累。其中,自然散射光、25℃、pH=5和摇床转速100r/min时L1菌株生物量积累较好;25℃、pH=5和摇床转速0r/min时,L1菌株总生物碱含量较高;25℃、pH=6和摇床转速0-100r/min时,L3菌株生物量积累较佳;15℃、pH=6和摇床转速100r/min时,L3菌株总生物碱含量较高。 五、通过对L1和L3菌株分别在其最适培养条件下培养15d、30d、45d,取样HPLC法测定其HupA含量的变化。结果表明当培养到30天时,L1菌株HupA达到最大积累,其含量为0.30μg/g;到45天时,L3菌株HupA积累达到最大值0.23μg/g。 六、分别用浓度为20μg/L、100μg/L、500μg/L的LAS盐对内生真菌L1和L3菌株进行诱导实验。研究结果表明,当LAS盐浓度分别为100μg/L和20μg/L时,L1菌株生物量和总生物碱含量分别增长23％、91%,均达最大;L3菌株在LAS盐浓度分别为20μg/L和100μg/L时,其生物量和总生物碱含量均达到最大,分别增长48%、79%。同时还发现,不同浓度LAS盐的加入,均能使L1和L3菌株产HupA含量增加。在0～500μg/L的浓度范围内,随着LAS盐浓度的增加,L1和L3菌株产HupA的含量亦呈现递增趋势;L1菌株递增程度较小,产HupA的含量分别增长44%、61%、93%;L3菌株产HupA含量增长趋势大,分别提高42%、3.95倍、13.30倍。