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抑制性差减杂交是一个产生差异表达或组织特异性cDNA探针及文库的高效率的新方法，适用于疾病、发育、组织特异性和其它差异表达基因的克隆研究。本研究按照Clontech公司PCR-SelectTM cDNA差减杂交试剂盒的说明，建立了基于PCR方法的凡纳滨对虾的差减杂交文库，用来筛选免疫刺激后表达的免疫相关基因。首先分别提取正常凡纳滨对虾和免疫刺激后对虾血细胞mRNA，合成双链cDNA，分别称为driver cDNA和tester cDNA。两种双链cDNA同时用Rsa I酶切，然后把testercDNA稀释后在同样的反应条件下分别与接头1(Adaptor 1)和接头2R(Adaptor 2R)连接，driver cDNA不加接头。接下来是两次杂交反应，在第二次杂交反应中，只有均化和消减后的单链tester cDNA能够重新杂交，形成新的5端有不同接头序列的杂交体。这两种接头序列使接下来在用巢式PCR引物1和巢式PCR引物2R两种引物进行PCR扩增时，差减和均化后的杂交体得到优先扩增。第二次PCR的产物与pMD18-T载体连接，转入DH5α细胞。通过对600个随机筛选的克隆的测序，用DNAMAN 5.2.2对560条高质量的ESTs进行聚类，共获得239个Unigenes(164contigs和75singletons)。ESTs与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比较，得出其中33.1％为未知功能基因，66.9％为已知功能基因，GO分类将其分为7类，包括能量和基础代谢类相关的基因为第一大类占36％，免疫相关基因占15％，其他基因占8％，信号转导类占3％，抗氧化酶和凋亡相关蛋白均为2％，核蛋白类占1％。与免疫功能相关的表达序列标签(ESTs)主要有溶菌酶、甲壳酶、α2巨球蛋白、粘蛋白、分子伴侣(热休克蛋白70/101，Clp B蛋白酶)、转录延伸因子1α、转录延伸因子3、转谷氨酰胺酶、磷酸激酶、核糖体蛋白、细胞自溶调节子、糖酵解和氧化呼吸有关的基因(丙酮酸脱氢酶，磷酸葡萄糖异构酶、细胞色素c氧化酶、氧化酶多肽和NADH脱氢酶)等。本文通过对文库的分析显示，基于PCR方法建立的SSH文库为取得大量免疫相关基因的ESTs序列提供了可能。