默诺霉素是一种强效抗生素,首先在班堡链霉菌(Streptomyces bambergiensis)的发酵产物中发现,目前主要用作动物饲料添加剂。在默诺霉素长达几十年的使用中,至今未有报道发现动物体内微生物菌群对默诺霉素有明显抗性。本文以班堡链霉菌ATCC 13879为研究材料,提取其总基因组DNA并随机剪切后得到40 kb左右的片段,对插入片段的末端进行修复,末端修复DNA经脉冲场凝胶电泳分离后与pCC1FOS载体成功连接,接着被包装蛋白包装进入噬菌体头部,转染宿主菌。本实验最终获得30000个克隆子,文库效价达6.0×104cfu/mL,实验随机挑取2880个克隆子于-80 ℃保存,远远多于公式计算出的所需的克隆数。随机挑取10个克隆提取质粒DNA检测,重组率接近100%。所构建的班堡链霉菌基因组文库符合要求。根据加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)ATCC14672默诺霉素生物合成基因M5序列设计引物,以此为探针,采用递缩PCR扩增技术对班堡链霉菌基因组文库进行筛选。通过第一轮对30个96孔板的筛选获得5个含有目的基因片段的阳性板,接着用同样的方法对5个阳性板的各行克隆子进行第二轮筛选,获得7个阳性行,最后对7个阳性行的各克隆进行第三轮筛选,获得8个含有M5基因片段的阳性克隆。接着根据加纳链霉菌ATCC 14672默诺霉素生物合成基因R5和A5序列设计引物,采用PCR扩增对8个阳性克隆进行筛选、验证,最终确定24F12为含有默诺霉素生物合成基因簇的目的克隆。经测序后得到默诺霉素生物合成基因簇基因序列,对序列进行简单分析发现,班堡链霉菌的默诺霉素生物合成基因簇序列长27763 bp,具有20个完整的开放阅读框(ORF),DNA序列与加纳链霉菌的moe簇1序列相似度达90%,编码的氨基酸序列与加纳链霉菌moe簇1编码的氨基酸大部分相似度较高,约为85%～93%。