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SY1蛋白结构中含有四个半LIM结构域,属于LIM超家族。L1M是3种转录因子Lin-11、Lsl-1和Mec-3的缩写,由约55个氨基酸残基组成,富含半胱氨酸,形成2个串联的锌指结构。它们在细胞和组织中特异性表达,参与调节细胞生存、转录和信号转导等,是细胞生长、细胞分化和细胞骨架重塑的重要调节因子。本课题组前期研究证实,SY1是重要的肿瘤抑制因子,并且还是一种基于G2/M期阻滞的具有辐射保护作用的辐射诱导基因。MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控,可通过与靶mRNA的3’-UTR区近乎完全互补结合在转录后水平使其降解,或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成。近几年研究发现,miRNA不仅与肿瘤的发生发展密切相关,通过调节细胞中的多条信号通路来影响肿瘤的发生、发展、增殖、分化、凋亡等,它们已成为重要的肿瘤生物标志物,潜在的肿瘤治疗靶标。同时,miRNA在辐射诱导的生物学反应过程中确实扮演重要角色,可以通过靶向辐射敏感调节关键基因达到调节肿瘤辐射敏感性的作用。本研究拟以SY1为靶点,筛选靶向调节SY1的miRNA。基于SY1在肿瘤调节和辐射调节中的双重重要作用,研究靶向SY1的miRNA在肿瘤生长调节和辐射敏感性调节中的功能。我们的研究首先通过TargetScan、miRanda软件预测得到可能靶向SY1基因的miRNA 17种,通过荧光素酶转录活性实验初步筛选出可能相互作用的miRNA。将SY1基因3’-UTR区插入到经过改造的荧光素酶报告基因载体pcDNA3.0(pcDNA3.0-luc)中构成pc3-luc-SYl,并将pc3-luc-SY1分别与上述17种miRNA分别共转染293T细胞,从转录活性水平进行筛选。同时,将上述17种miRNA分别转染293T细胞,Western blot结果显示miRNA对293T细胞内源SY1蛋白水平的调节作用。综合转录活性实验和Western blot结果,miR-410等5种microRNA能够从转录活性和蛋白表达水平对SY1进行下调作用,提示本研究靶向SY1的miRNA筛选的可靠性。进一步,我们构建不同miRNA靶向SY1基因3’-UTR种子区缺失的突变体,通过比较miRNA和缺失突变体共转染情况下与miRNA和野生型共转染荧光素酶活性是否回复,判断该miRNA是否直接作用于SY1 3’-UTR。本研究结果表明miR-410直接作用于SY1基因的3’-UTR区来下调SY1的表达。我们挑取miR-410和另两种对SY1下调作用明显的miRNA(miR-495和miR-214)进行功能实验。在体外实验中,通过构建miRNA过表达的ZR75-1和HepG2稳定细胞系,利用CCK-8测定绘制生长曲线,证实过表达三种miRNA具有促进肿瘤细胞生长的功能;同时在体内实验中,通过裸鼠皮下接种过表达miRNA的ZR75-1和HepG2稳定细胞系,测量裸鼠肿瘤生长情况,证实过表达miR-410、miR-495和miR-214可以促进肿瘤细胞的生长。在敲低SY1的细胞系中过表达3种miRNA,证实miR-410、miR-495和miR-214主要通过靶向SY1来影响细胞的生长。此外,乳腺和肝脏临床标本检测发现,在20例乳腺癌患者组织中,有14例癌组织miR-410表达高于癌旁组织;在20例肝癌患者组织中,有16例癌组织miR-410表达高于癌旁组织。基于SY1在肿瘤调节和辐射调节中的重要作用,我们同时研究miR-410、miR-495和miR-214在辐射敏感性调控中的调控特点和作用。与辐射前相比,辐射后miR-410、miR-495表达水平降低,而miR-214的表达水平升高。通过构建SY1、p53敲低稳定细胞系,证实3种miRNA的辐射变化并不依赖于SY1和p53。在考察miRNA对肿瘤细胞辐射敏感性的调节中,首先,体外实验构建miRNA过表达的ZR75-1和HepG2稳定细胞系,经过4Gy60Co-γ射线照射。克隆存活实验表明辐射条件下过表达miR-410对肿瘤细胞辐射敏感性影响不大,过表达miR-495和miR-214可以提高肿瘤细胞的辐射敏感性。其次,利用构建的稳定细胞系进行裸鼠皮下成瘤后,经过4Gy60Co-γ射线多次局部照射,通过测量瘤体积,证实体内情况下,miR-410并不影响肿瘤细胞的辐射敏感性,miR-495和miR-214可以提高肿瘤细胞的辐射敏感性,且miR-214的增敏效应最强。有意思的是,miR-495体内辐射增敏模型中其肝脏坏死程度小,提示可能减轻辐射旁效应作用,具体研究和机制有待深入阐明。综上所述,miR-410、miR-495和miR-214可以通过下调SY1的表达,促进肿瘤细胞的生长,其中,miR-410是通过直接靶向SY1的3’-UTR区来下调SY1的表达,而miR-495和miR-214下调SY1的机制还需要进一步考察。体内、外实验表明miR-495和miR-214使肿瘤细胞具有辐射增敏作用,具体调节机制有待深入研究。miR-495和miR-214的增敏效应对于肿瘤的放射治疗具有重要的意义,是肿瘤基因治疗的新的候选靶标。