【摘 要】
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近年来舒伯特气单胞菌引起的内脏类结节病在养殖鳢科鱼类中频繁爆发,该病病程短、死亡率高、传播速度快,已经成为鳢养殖业的主要病害之一,造成了巨大的经济损失。目前舒伯特气单胞菌相关研究较少,大多集中在细菌分离鉴定以及药物敏感性分析等方面,而对其毒力因子和致病机制的研究报道较少。过氧化氢酶（Hydrogen Peroxidase）,是广泛存在于微生物和动植物中的一种氧化酶,也是一些病原菌重要的毒力因子,研
【基金项目】
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广东省科技计划项目（2016A030303028）； 现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-46）； 中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2017HY-ZC0406）；
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近年来舒伯特气单胞菌引起的内脏类结节病在养殖鳢科鱼类中频繁爆发,该病病程短、死亡率高、传播速度快,已经成为鳢养殖业的主要病害之一,造成了巨大的经济损失。目前舒伯特气单胞菌相关研究较少,大多集中在细菌分离鉴定以及药物敏感性分析等方面,而对其毒力因子和致病机制的研究报道较少。过氧化氢酶（Hydrogen Peroxidase）,是广泛存在于微生物和动植物中的一种氧化酶,也是一些病原菌重要的毒力因子,研究发现过氧化氢酶能帮助病原菌抵御宿主免疫细胞中过氧化物的毒害,在致病菌逃避宿主天然防御过程中发挥作用。为研究舒伯特气单胞菌过氧化氢酶对细菌毒力的影响,本课题采用同源重组基因编辑技术构建过氧化氢酶cat基因缺失株Δcat,同时构建其重组质粒制备回补株C-cat。通过对缺失株、回补株和野生株的菌落形态、溶血活性、生长曲线、酸碱耐受能力等生物学特性和触酶活性、过氧化氢酶活力、过氧化氢酶耐受、巨噬细胞存活实验及对杂交鳢致病性等致病特性进行比较研究,探讨过氧化氢酶在舒伯特气单胞菌致病过程中的作用,为舒伯特气单胞菌病的防控奠定基础。主要研究结果如下:（1）成功构建过氧化氢酶cat基因缺失株Δcat和回补株C-cat。连接舒伯特气单胞菌过氧化氢酶cat基因和氯霉素基因到质粒p SET4s中构建温敏自杀质粒p SET4s-cat,采用同源重组的方法成功敲除野生株WL-2中581bp cat基因片段,构建舒伯特气单胞菌过氧化氢酶缺失株Δcat;将重组质粒p Smart-cat转入缺失株Δcat中,构建回补株C-cat。为验证过氧化氢酶在野生株、缺失株和回补株中的表达情况,在分子水平上采用荧光定量PCR方法检测三种菌株中cat基因的表达量发现,缺失株中cat基因无表达,回补株中cat的表达量为野生株中的的0.69倍。在蛋白水平上,本研究还用原核表达舒伯特气单胞菌过氧化氢酶CAT蛋白,制备抗CAT多克隆抗体,建立了CAT蛋白Western blot检测方法。采用建立的方法检测三种菌株中CAT的表达发现:缺失株Δcat无CAT蛋白表达,野生株WL-2和回补株C-cat有大小为56k Da的CAT蛋白表达,且野生株中的CAT蛋白表达量高于回补株。因而,本研究从分子和蛋白表达水平验证了舒伯特气单胞菌过氧化氢酶cat基因缺失株和回补株的成功构建。（2）野生株WL-2、缺失株Δcat和回补株C-cat的生物学特性比较研究。在5%绵羊血琼脂平板28℃培养24 h后发现,三种菌落大小一致,均呈灰白色、湿润、表面光滑、直径0.6～2.0 mm的圆形菌落;三株菌培养48h后均呈弱的β-溶血;对三株菌生长特性分析发现,三株菌的生长曲线无明显差异,在2h和16h分别进入对数生长期和平台期,生物学特性比较研究表明cat基因缺失与野生株和缺失株在菌落形态、溶血特性及生长状态无明显关联。（3）野生株WL-2、缺失株Δcat和回补株C-cat致病性的比较研究。触酶实验发现,缺失株降解过氧化氢能力显著低于野生株和回补株;过氧化氢存活实验显示,缺失株对H2O2的耐受能力低于野生株和回补株,而回补株对H2O2有一定的耐受能力但未恢复到野生株的水平;过氧化氢酶活性测定结果显示,缺失株Δcat过氧化氢酶活性较低,而回补株C-cat过氧化氢酶活性有所升高但未恢复至野生株水平;三株菌在巨噬细胞中存活试验发现,缺失株Δcat在巨噬细胞中存活能力显著低于野生株WL-2（P＜0.05）和回补株C-cat,回补株在巨噬细胞存活能力有回复,但低于野生株;杂交鳢致病性实验结果显示,三株菌分别在30℃1×10~6CFU/ml浸泡感染杂交鳢2h后,野生株感染组实验鱼死亡率100%,缺失株感染组无死亡,回补株感染组死亡率为50%。表明过氧化氢酶基因缺失导致舒伯特气单胞菌致病力降低,回补株过氧化氢酶基因后其致病力有所恢复,但未达到野生株水平。综上,本研究成功构建了舒伯特气单胞菌过氧化氢酶cat基因缺失株及其回补株。进一步研究发现cat基因缺失对舒伯特气单胞菌的菌落形态、溶血特性及生长状态影响较小;cat基因缺失降低舒伯特气单胞菌降解过氧化氢能力、在宿主巨噬细胞中的存活能力及其致病能力。推测过氧化氢酶在舒伯特气单胞菌感染过程中的致病机制为:舒伯特气单胞菌被巨噬细胞吞噬后,通过其的过氧化氢酶降解溶酶体中的过氧化氢逃避巨噬细胞的灭杀作用。本研究为进一步研究舒伯特气单胞菌的致病机制提供基础,对舒伯特气单胞菌的防控具有重要作用。
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