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研究背景:免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是一种获得性免疫性疾病,由于机体体液免疫和细胞免疫功能异常,产生的血小板自身抗体、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T cells,CTL)等均可与血小板结合,介导血小板的过度破坏,引起血小板减少导致出血,其特点是血小板数量减少、皮肤粘膜出血、骨髓巨核细胞成熟障碍、多半病人可检测到抗血小板自身抗体。自噬(autophagy)是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome),并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身代谢需要和细胞器更新的过程,是用来维持细胞内环境稳定、防御及正常生长控制的机制。自噬活性过高或过低均可导致多种疾病,其中自体吞噬功能失调与许多不同疾病的发生和发展有关。最新研究发现,自噬在无核细胞,包括血小板中同样可以表现;血小板自噬的发生依赖Ⅲ型PI3K的活性;自噬对于维持血小板的功能有重要作用,调节正常人血小板可影响血小板粘附、聚集、活化、凋亡等功能。但血小板自噬是否参与ITP的发生发展,尚未阐明。我们结合最新进展和我们的研究工作基础提出假说:血小板自噬及其调节通路PI3K/Akt/mTOR异常参与了ITP患者的发病机制;调节血小板自噬可能成为ITP有效地治疗干预策略。通过对ITP患者血小板自噬和调控机制研究,探讨血小板自噬在ITP发生发展过程中起到的作用;PI3K/Akt/mTOR信号通路在血小板自噬中的作用;以及小分子化合物调节血小板自噬对ITP患者血小板功能的影响。为ITP的治疗奠定理论和实验基础、开拓新的治疗靶点。第一部分ITP患者血小板自噬水平及调节通路研究研究目的:(1)通过研究ITP患者中血小板的自噬程度及功能变化,确定血小板白噬在ITP的发生发展过程中起到的作用;(2)探讨PI3 K/Akt/mTOR信号通路在血小板自噬中的作用;(3)确定小分子化合物ABO(6-氨基-2,3-二氢-3-羟甲基-1,4-苯并恶嗪;6-amino-2,3-dihydro-3-hydroxymethyl-1,4-benzoxazine)调节血小板自噬的最佳浓度;(4)探索小分子化合物ABO对血小板自噬调节的影响。研究对象与方法:(1)采集ITP初诊患者(n=45)与正常人(n=40)外周血,分离并提取外周血血小板。(2)免疫荧光法染色血小板中 LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3),激光共聚焦显微镜观察LC3点状聚集情况。(3)蛋白质印迹(Westernblot)检测血小板中LC3-I向LC3-Ⅱ的转换以及p62蛋白的表达。(4)分离并提取血小板,加入小分子化合物ABO培养2h,ABO浓度分别为0μmol/L,25μmol/L,50 μmol/L,100 μmol/L,确定ABO调节血小板自噬的最佳浓度。(5)取ITP初诊患者与正常人外周血,分离并提取血小板,分别加入mToR特异抑制剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA;终浓度200 nM)、PI3KⅢ的抑制剂3-MA(3-methyladenine;终浓度 10 mM)、小分子化合物ABO(终浓度50μM)培养2h。(6)免疫荧光法染色检测培养前后的血小板中LC-3,激光共聚焦显微镜观察LC-3点状聚集情况。(7)Western blot检测培养前后的血小板中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换以及p62蛋白的表达。结果:(1)ITP患者与正常人外周血血小板中均存在自噬相关蛋白LC3、P62,LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转换证实自噬存在于ITP患者与正常人血小板中。(2)ITP患者外周血血小板细胞质内LC3蛋白标记的阳性荧光均匀、分散、模糊,点状聚集明显少于正常人。ITP患者血小板LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较正常人血小板明显减小(0.3380±0.0447 vs.0.8440±0.0686,P<0.01),LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转换减少,提示ITP患者血小板自噬减低。(3)ITP患者与正常人外周血血小板,经过RAPA(终浓度200 nM)处理后,LC3阳性荧光点状聚集均较前明显浓密、数量增加,效果与正常对照相似;该作用均可被3-MA抑制。ITP患者血小板经RAPA处理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较处理前明显增加(0.8960±0.1088 vs.0.3380±0.0447,P<0.01),与正常对照无明显差异(0.8960±0.1088 vs.0.8440±0.06856,P=0.6906);该作用可被3-MA抑制(0.8960±0.1088 vs.0.3020±0.0550,P<0.01)。(4)ITP患者外周血血小板,经过NH4C1、CQ等溶酶体抑制剂处理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值均较前明显增大,其作用效果与RAPA组效果一致,;CQ组及NH4Cl组P62蛋白含量均较前增加,该作用与RAPA组效果相反。(5)ABO调节血小板自噬的最佳浓度为50 μmol/L。(6)ITP患者外周血血小板,经过ABO(终浓度50μmol/L)处理后,LC3阳性荧光点状聚集较前明显浓密、数量增加,该作用效果与RAPA处理后效果相似,与正常对照组效果相似。ITP患者血小板经ABO处理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较前明显增加(0.8560±0.0970 vs.0.3380±0.0447,P<0.01);该作用效果RAPA处理后效果无明显差异(0.8560±0.0970 vs.0.8960±0.1088,P=0.1066;0.8560±0.0970 vs.0.8440±0.0686,P=0.4231);该作用可被3-MA抑制(0.9350±0.0829 vs.0.1750±0.0354,P<0.01)。结论:(1)正常人及ITP患者血小板均存在自噬的发生。(2)ITP患者血小板自噬较正常人明显受到抑制,可能是ITP患者血小板破坏的机制之一。(3)自噬调节通路PI3K/Akt/mTOR通路参与了正常人及ITP患者血小板自噬的调节,调控PI3K/Akt/mTOR通路,可调节ITP患者血小板自噬。(4)ITP患者血小板自噬过程存在基础自噬流,使用溶酶体抑制剂,自噬流可被抑制。自噬流的存在及调控,进一步证实了血小板自噬过程的完整性。(5)小分子化合物ABO参与了 ITP患者血小板自噬的调节,ABO调节血小板自噬的最佳浓度为50 umol/L。(6)小分子化合物ABO可以明显提高ITP患者血小板自噬水平,对ITP患者血小板自噬调节,提供了新的选择,对抑制ITP的发生发展及ITP的治疗提供了新的理论依据。第二部分调节自噬对ITP患者血小板的保护作用研究目的:通过调节ITP患者血小板自噬,研究自噬对ITP患者血小板凋亡、血小板活性的影响,以确定调节自噬对ITP患者血小板的保护作用。研究对象与方法:(1)采集ITP初诊患者(n=25)与正常人(n=25)外周血,分离并提取血小板。(2)ITP患者外周血血小板中,分别加入RAPA(终浓度200 nM)、3-MA(终浓度10 mM)、小分子化合物ABO(终浓度50 μM)培养2h,分离培养后的血小板。(3)线粒体膜电位法检测血小板凋亡,流式细胞术定量检测血小板中JC-I monomers(FL1)与JC-1 aggregates(FL2)的表达。(4)Annexin V标记血小板,通过流式细胞术检测血小板中annexin V的表达,确定血小板凋亡。(5)CCK-8法检测血小板活性,酶标仪测定450 nm处的吸光值。结果:(1)线粒体膜电位检测法,检测血小板凋亡。ITP患者血小板凋亡高于正常对照(P<0.05)。经过RAPA处理,ITP患者血小板凋亡显著降低(P<0.01),与正常对照组无明显差异(P=0.6150),此功能可被3-MA阻断(P<0.01)。经过ABO处理,ITP患者血小板凋亡显著降低(P<0.05),与正常对照组和RAPA组无明显差异(P= 0.6988 vs.controls;P=0.0693 vs.RAPA),此功能可被3-MA阻断(P<0.05)。(2)Annexin V试剂盒,检测血小板凋亡。ITP患者血小板凋亡高于正常对照(P<0.05)。经过RAPA处理,ITP患者血小板凋亡显著降低(P<0.05),与正常对照组无明显差异(P= 0.4912),此功能可被3-MA阻断(P<0.05)。经过ABO处理,ITP患者血小板凋亡显著降低(P<0.05),与正常对照组和RAPA组无明显差异(=0.3537 vs.controls;P=0.1745 vs.RAPA),此功能可被3-MA阻断(P<0.05)。(3)ITP患者血小板活性低于正常对照(P<0.05)。经过RAPA处理,ITP患者血小板活化显著增加(P<0.01),与正常对照组无明显差异(P=0.6578),此功能可被3-MA阻断(P<0.01)。经过ABO处理后,ITP患者血小板活化显著增强(P<0.05),与正常对照组和RAPA组无明显差异(P=0.4684 vs.controls;P=0.1255 vs.RAPA),此功能可被3-MA阻断(P<0.01)。结论:(1)ITP患者自噬减低,造成血小板修复、再生的障碍,并通过mTOR影响PI3K/Akt/mTOR通路,在ITP血小板凋亡的发生发展起到推动作用;增强血小板自噬可通过抑制血小板凋亡、提高血小板存活能力,延长ITP患者血小板的寿命,对ITP患者血小板产生保护作用(2)ABO可以同时增强血小板自噬、降低血小板凋亡,可能是自噬与凋亡的交互调节因子之一;通过ABO增强血小板自噬,可有效降低ITP患者血小板凋亡、提高血小板存活能力,延长ITP患者血小板的寿命,对ITP患者血小板产生保护作用。