研究背景钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是一种随年龄而增加的以瓣膜内大量钙质沉积为特征的老年人常见的心脏瓣膜病变,主要表现为主动脉瓣进行性增厚钙化,瓣膜狭窄和（或）关闭不全。CAVD包括主动脉瓣钙化（AVC）与钙化性主动脉瓣狭窄（CAS）两种类型。钙盐结晶沉积在心脏瓣膜上,可引起瓣膜形态改变以及心脏血流动力学紊乱。目前尚没有专门针对其有效的药物疗法,手术治疗有其应用的局限性,需长期口服抗凝药物的患者,出血性风险大大增加;由于患者常合并有其他疾病,有部分患者无法耐受外科手术;生物瓣膜目前使用寿命有限,可再发生退行性变,因此研究钙化性主动脉瓣疾病的防治方法和检测手段显得尤为重要。长期的高糖血症可使体内的低密度脂蛋白（LDL）发生非酶糖基化反应,形成晚期糖基化终产物（AGE）修饰的LDL（AGE-LDL）。AGE-LDL在体内大量蓄积,并通过血管内皮细胞等组织细胞表面或受体的介导,刺激促炎症介质释放,导致组织损伤。Yamagishi等1流行病学发现在糖尿病患者的血浆中,AGE-LDL的水平升高和动脉粥样硬化及冠心病的发生具有正相关。本研究推测AGE-LDL在主动脉瓣膜钙化反应中的作用,预想作为监测钙化性主动脉瓣膜疾病的一个有效指标。晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）是介导AGEs促内皮细胞凋亡、促增殖作用的跨膜免疫球蛋白超家族受体,广泛表达在内皮细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞和单核细胞。已有研究表明2AGEs与RAGE受体相互作用,产生一系列氧化应激和炎症反应,AGEs/RAGE轴与血管平滑肌细的表型转化、动脉中膜钙化过程有着密切的联系。AGEs和LDL的结合物可以与人冠状动脉内皮细胞、巨噬细胞、肾小管上皮细胞的TLR4受体相互作用,活化细胞内的p38、JNK、ERK激酶和NF-κB等转录因子,从而产生一系列炎症反应。主动脉瓣膜间质细胞表面功能性的TLR4在一定条件诱导下能促进间质细胞释放炎症因子ICAM-1、IL-6,骨化因子BMP-2、ALP表达增多,进而诱导主动脉瓣膜钙盐沉积反应。目前关于AGE-LDL和TLR4/RAGE在钙化性主动脉瓣疾病中作用的研究暂未发现,因此在本研究中我们探讨了 TLR4/RAGE在主动脉瓣膜间质细胞炎症反应中的作用及其可能的分子机制。TLR4/NF-KB信号传导途径在人主动脉瓣膜间质细胞中介导的炎症反应已有证实,而RAGE基因启动子上有两个NF-κB结合位点,AGE可通过与RAGE相互作用激活NF-κB等其它下游信号转导通路,介导生长因子、细胞因子、黏附分子表达,从而促进多种细胞因子及炎症因子释放。Husseini3等研究发现IL-6能诱导血管细胞和瓣膜细胞向成骨细胞方向分化,这些炎症介质使炎症细胞聚集并激活释放更多的炎症因子,促进细胞外基质的重构和矿物质沉积。白介素37（interleukin 37,IL-37）属于白介素1家族,其有5个剪接变体存在（IL-37a-e）,目前尚未发现小鼠表达,但人IL-37能在小鼠体内发挥作用。IL-37可在多种正常组织及肿瘤组织中表达,如:淋巴结、扁桃体、胸腺、子宫、乳腺癌、前列腺癌。IL-37前体由Caspase 1处理至成熟形式,随后结合SMAD3转位到细胞核。SMAD3/IL-37复合物抑制细胞核中的促炎性因子基因转录,抑制下游信号转导途径,包括NF-κB和MAPK途径。体内实验已经证明人转基因小鼠对结肠炎模型有保护作用;体外实验研究发现IL-37可减少肝细胞和枯否氏细胞释放的促炎性细胞因子和趋化因子。明确IL-37在AGE-LDL诱导主动脉瓣膜钙化的调节作用,有助于加强对炎症性疾病的认识,可能对寻找钙化性主动脉瓣疾病的潜在防治靶点和检测手段提供理论依据。本研究利用AGE-LDL刺激HAVICs的RAGE受体和TLR4受体,探讨人IL-37对AGE-LDL介导的炎症反应的调节作用及可能的机制,本研究将分两部分进行。第一部分晚期糖基化低密度脂蛋白在人主动脉瓣膜间质细胞诱导的炎症反应目的分析晚期糖基化低密度脂蛋白（AGE-LDL）在人主动脉瓣膜间质细胞（HAVICs）介导的炎症反应及其作用机制。方法非钙化性主动脉瓣瓣膜组织（non-CAVD）是从主动脉瓣膜脱垂患者术后标本取材,本实验中我们收集6例（男性4例,女性2例）。而主动脉瓣狭窄（CAVD）的主动脉瓣组织是从由于钙化性主动脉瓣狭窄而进行主动脉瓣膜置换术患者被置换出来的主动脉瓣膜中取材,本实验中我们收集8例（男性5例,女性3例）。用免疫组化方法对比钙化组和非钙化组瓣膜组织中晚期糖基化终产物（AGE）、toll样受体4（TLR4）和晚期糖基化终产物受体（RAGE）的表达水平。从主动脉瓣脱垂的瓣膜膜组织分离出HAVICs,随机分为空白对照组给予等体积的M199培养液、LDL组给予100μg/ml LDL培养液、AGE-LDL组分别给予50、100、200μg/ml AGE-LDL培养液,各组干预48h。ELISA检测细胞上清液IL-6和IL-8的分泌水平。应用基因沉默的方法减少TLR4和RAGE蛋白表达量,Western-blot检测ICAM-1和IL-6的表达量。用晚期糖基化低密度脂蛋白（AGE-LDL）进行干预0.5h、1h、2h、4h、8h,Western-blot检测NF-κB信号通路的活化水平。应用NF-κB抑制剂BAY11-7082抑制NF-κB的磷酸化,检测ICAM-1和IL-6蛋白的表达水平。结果免疫组化显示CAVD组瓣膜标本AGE、TLR4及RAGE表达量较Non-CAVD组表达量增多。与空白对照组、LDL组比较,AGE-LDL组的ICAM-1、IL-6蛋白表达水平和IL-6、IL-8分泌水平呈剂量依赖性明显增高（P均<0.05）;空白对照组、LDL组以上指标组间比较,P均>0.05。AGE-LDL诱导的NF-κB磷酸化水平增高,2h后达到峰值,4h后开始减弱;BAY11-7082能抑制AGE-LDL诱导的NF-κB磷酸化水平及ICAM-1、IL-6蛋白的表达水平。小结AGE-LDL通过识别人主动脉瓣间质细胞表面的TLR4和RAGE受体介导炎症反应,其作用机制可能与NF-κB信号通路活化有关。第二部分 IL-37对晚期糖基化低密度脂蛋白诱导的炎症反应的调节作用目的探索白介素37（IL-37）在主动脉瓣膜间质细胞（HAVICs）对AGE-LDL介导的炎症反应的抑制作用及其机制。方法用免疫组化方法对比钙化组（CAVD）和非钙化组（non-CAVD）瓣膜组织中IL-37蛋白表达水平。从主动脉瓣脱垂瓣膜组织分离出人主动脉瓣间质细（HAVICs）,随机分为空白对照组给予等体积的M199培养液、AGE-LDL组给予100μg/ml AGE-LDL培养液,IL-37组用IL-37提前干预1h,然后用AGE-LDL刺激HAVICs,每3天换液1次,21天后用茜素红染色方法观察主动脉瓣膜间质细胞钙盐沉积情况。然后将HAVICs再随机分为空白对照组给予等体积的M199培养液、DMSO组给予1‰ DMSO培养液,AGE-LDL组给予100μg/ml AGE-LDL培养液,IL-37组用IL-37提前干预1h,然后用AGE-LDL刺激,各组均干预48h,Western-blot检测ICAM-1和IL-6蛋白表达水平。最后,用IL-37提前干预 1h,然后用 AGE-LDL 刺激 HAVICs 0.5h,1h,2h,4h,8h,Western-blot 检测NF-κB的磷酸化水平。应用NF-κB抑制剂BAY11-7082抑制NF-κB的磷酸化,Western-blot检测ICAM-1和IL-6蛋白的表达水平。结果non-CAVD组瓣膜组织的IL-37表达水平比CAVD组高。IL-37处理组的ICAM-1和IL-6蛋白表达水平较AGE-LDL组明显降低。NF-κB抑制剂BAY11-7082能抑制NF-kB的磷酸化,且ICAM-1和IL-6的蛋白表达水平明显降低。小结白介素37在主动脉瓣膜间质细胞可通过抑制NF-κB信号通路的活性抑制晚期糖基化低密度脂蛋白介导的炎症反应。结论1.AGE-LDL可以通过Toll样受体4（TLR4）和AGE受体（RAGE）介导人主动脉瓣膜细胞（HAVICs）产生ICAM-1和IL-6,其作用机制与NF-κB信号通路的活化有关。2.白介素37可通过抑制NF-κB信号通路的活性抑制糖基化修饰的低密度脂蛋白介导主动脉瓣膜间质细胞的炎症反应,具有防治钙化性主动脉瓣膜疾病进展的潜力。