研究背景:肺癌是一种多病因的疾病,在众多的致病因素中,放射性氡及其子体被认为是继吸烟之后导致肺癌的第二位危险因素,也是不吸烟者中的第一位危险因素。氡（Radon,Rn）是一种无色无味的放射性气体,已被国际癌症组织和美国环境保护局定为人类致癌物。长期的氡暴露还可增加不吸烟者的肺癌发生率,这通常与TP53基因的突变有关。肿瘤抑制基因TP53的变异能够通过不同的方式促进人类癌症的发生与发展,在几乎所有类型的人类癌症中都能观察到TP53基因的突变。线粒体是细胞功能维持和增殖所必需的细胞器,是物质代谢和能量代谢的重要场所,现在普遍认为线粒体结构和功能异常与肿瘤的发生发展密切相关。TP53基因通过与Bc12蛋白质家族的多结构域成员发生作用,参与内在的凋亡途径,诱导线粒体外膜通透性（mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP）改变,导致释放线粒体膜间隙蛋白（如Cyt-c）,从而参与细胞凋亡。尽管MOMP的确切调控机制尚不完全清楚,但已知MOMP受促凋亡和抗凋亡Bc12家族蛋白之间的相互作用调节。研究目的:在以往氡致肺癌的实验研究中,主要关注的生物学效应是氡及其子体对细胞核DNA的突变损伤,而很少考虑对核外细胞器,特别是对线粒体的损伤作用。本课题以TP53野生型人支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞）构建长期染氡模型,探讨TP53通过线粒体介导氡致肺癌的作用机制。通过一系列体内、体外实验,观察氡染毒和TP53敲除对细胞和线粒体的损伤作用,然后通过高通量测序和生物信息学分析,筛选并验证TP53靶向的线粒体相关基因,从而为阐明氡致肺细胞恶性转化的机制提供新的实验证据。方法:（1）体内外实验观察染氡和/或TP53敲除的损伤效应。体内实验,利用课题组前期建立的氡吸入染毒小鼠模型,将氡吸入染毒小鼠分为四组:对照组（Control）、低剂量组（30WLM）、中剂量组（60WLM）和高剂量组（120WLM）。染氡结束后,取各组小鼠肺组织分别进行HE染色,观察肺部病理改变,提取DNA进行线粒体DNA拷贝数测定,提取蛋白进行p53蛋白表达测定。体外实验,构建TP53基因敲除和/或长期染氡致细胞恶性转化模型,共分为四组,即正常传代对照BEAS-2B细胞组（BEAS-2B）、TP53敲除细胞组（TP53-/-）、单独染氡细胞组（Rn）和TP53敲除后染氡细胞组（TP53-/-+Rn）。细胞处理完成后通过软琼脂克隆形成实验分析各组细胞的克隆形成能力,采用EdU和CCK-8细胞增殖实验观察各组细胞的增殖能力,进行划痕实验和Transwell实验分析各组细胞的迁移能力,通过流式细胞术分析各组细胞的线粒体膜电位改变,分离细胞质和线粒体蛋白通过Western blot测定促凋亡蛋白BAX、Cyt-c和抗凋亡蛋白Bcl2的表达差异,同时提取DNA进行qPCR检测观察各组细胞线粒体DNA拷贝数变异情况。（2）对TP53敲除和/或染氡的细胞进行高通量测序和生物信息学分析。提取上述四组细胞的总RNA,进行转录组学高通量测序。通过两两差异分析方法,在TP53-/-、Rn和TP53-/-+Rn组细胞中筛选出与正常传代BEAS-2B细胞相比异常表达的基因。采用DAVID在线工具对差异表达基因进行GO（Gene Ontology,基因本体）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因组百科全书）通路富集分析。TRIZol法提取各组细胞的总RNA进行qPCR测定,对上述高通量分析鉴定出的前5个上调和下调的基因进行mRNA表达水平验证。利用TCGA（The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图谱）数据库中肺腺癌（LUAD,Lung adenocarcinoma）和肺鳞癌（LUSC,Lung squamous cell carcinoma）的mRNA表达数据,分析上述高通量分析鉴定的前5个上调和下调的基因在肺癌组织和癌旁正常组织的表达差异,进一步采用R语言“Mfuzz”包,对各组细胞的表达数据进行转录组表达模式聚类分析,以筛选TP53基因敲除和染氡处理协同作用的受影响基因。结合文献和基于TCGA数据库的生物信息学分析,从上述聚类分析得到的基因中进一步筛选出TP53基因敲除和/或染氡后与线粒体相关的差异表达关键基因。（3）基因敲低和过表达与通路分析验证染氡和TP53敲除的作用机制。采用Western blot测定TP53敲除和/或染氡细胞中BTG2基因的蛋白表达,通过qPCR测定和免疫组化分析,验证染氡小鼠模型肺组织中BTG2和BCL2的mRNA表达水平。分别以pGreen质粒和pCDH质粒为骨架构建BTG2和BCL2的敲低shRNA质粒和过表达质粒,然后分别转染正常BEAS-2B细胞和TP53敲除细胞,通过Western blot检测转染细胞中MOMP相关分子标志物BAX和Cyt-c的线粒体内外分布差异,并通过流式细胞术检测转染细胞线粒体膜电位和细胞凋亡水平改变。应用癌症基因组图谱TCGA数据库和基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）,分析BTG2在癌旁正常组织和肺癌组织中的表达差异,并基于在线工具KMplot对BTG2进行生存分析。结果:（1）染氡小鼠肺组织改变。染氡小鼠肺组织HE染色结果显示,不同剂量氡染毒组小鼠肺组织中,出现不同程度的病理性改变,表现为肺组织实变、肺泡融合、肺泡变小甚至消失,肺间质增厚。各剂量染氡组小鼠肺组织线粒体DNA拷贝数显著增加,p53蛋白的表达量降低,并呈现剂量-效应关系,以120WLM高剂量氡染毒组的线粒体拷贝数上升最多,显著高于30WLM低剂量和60WLM中剂量组,高剂量组p53表达下降最大,显著低于低剂量和中剂量组。体外实验方面,BEAS-2B细胞TP53敲除和/或染氡后功能改变。BEAS-2B细胞长期氡暴露后,TP53-/-和Rn组细胞表现出一致的变化,即凋亡率降低、软琼脂克隆形成率增加、细胞的增殖能力和迁移能力增强。与这些细胞生长特性的改变相对应,线粒体的功能调控也发生了相应变化,表现为Bcl2蛋白表达增多,线粒体外膜上凋亡蛋白BAX的减少以及线粒体膜间隙中Cyt-c的增多,线粒体膜电位升高和线粒体DNA拷贝数增加。与Rn和TP53-/-组相比,二者联合组（TP53-/-+Rn）线粒体的改变显著高于单独TP53敲除和单独氡染毒组,表明二种处理因素对线粒体的效应和细胞恶性转化过程具有协同作用。（2）TP53敲除和/或染氡细胞高通量测序数据生物信息学分析结果。高通量测序与富集分析表明,在TP53-/-和染氡细胞中出现一系列差异表达的基因,且显著富集在多条与肿瘤相关的生物学功能和信号通路上,包括调控C-ytc从线粒体的释放以及细胞增殖、迁移和凋亡等生物学过程,以及PI3K-Akt、TNF和NF-κB信号等通路。基于TCGA数据库的分析表明,差异表达的前5个上调或下调的基因在肺癌组织中大部分都表现出一致的变化,且差异显著。通过聚类分析将所有基因聚成6类,对其中表达持续下调的Cluster 2和持续上调的Cluster 3中的基因,进行蛋白关联网络（PPI）分析后,筛选出与TP53相关的76个基因。富集分析显示这些基因与凋亡性线粒体改变和线粒体DNA损伤检查点以及肿瘤相关的信号通路相关。进一步分析了这76个基因在TCGA肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）中的表达,结果表明,在LUAD和LUSC中均显著上调的11个基因中有8个在上述聚类分析的Cluster3中,即在染氡细胞和TP53敲除后染氡细胞中持续上调;而在下调的11个基因中有6个在Cluster2中,即在染氡细胞和TP53敲除后染氡细胞中持续下调。通过文献检索,结合TCGA数据库生物信息学分析,筛选出2个与线粒体改变和TP53异常相关性最强的基因,即抗增殖肿瘤抑制基因BTG2和抗凋亡基因BCL2。（3）TP53靶向线粒体相关基因BCL2和BTG2的功能验证。对筛选出的BTG2基因采用Western blot进行蛋白表达水平的验证,其结果与高通量测序mRNA结果一致,四组细胞中,BTG2基因的表达由高到低为BEAS-2B＞Rn＞TP53-/-＞TP53-/-+Rn。小鼠肺组织免疫组化结果显示,氡暴露能够显著提高肺组织BCL2蛋白表达,降低BTG2蛋白表达。在TP53野生型细胞中,过表达BCL2或敲低BTG2后线粒体中的BAX显著降低而Cyt-c显著升高,细胞凋亡水平降低,线粒体膜电位升高。敲低BCL2或过表达BTG2能够显著挽救TP53敲除引起的MOMP改变、凋亡水平的降低,以及线粒体膜电位的升高。生物信息学数据分析结果表明BTG2在肺癌组织中显著低表达,其表达改变与肿瘤分期、浸润深度和患者预后相关。结论:（1）氡染毒致小鼠肺组织的损伤,伴有p53表达下调和线粒体DNA拷贝数的增加。人支气管上皮细胞TP53敲除和/或染氡均导致细胞凋亡率降低,增殖能力和迁移能力增强,同时线粒体的形态和功能也发生了相应的变化,表现为线粒体外膜通透性改变,线粒体膜电位升高和线粒体DNA拷贝数增加。这些改变在TP53敲除细胞中更加明显,提示TP53基因参与了线粒体介导的细胞恶性转化过程。（2）TP53敲除和染氡后出现的差异表达基因,其生物学功能大多富集在与肿瘤相关的信号通路上,并与线粒体的凋亡功能密切相关。通过对基因表达模式的生物信息学分析,筛选出2个与TP53靶向线粒体相关的基因BCL2和BTG2。（3）在动物和细胞水平上,证实了 BCL2和BTG2在TP53敲除和染氡致BEAS-2B细胞恶性转化和线粒体功能改变中发挥重要作用。