抑制自噬通过上调溶酶体膜Hsp 70.1B增强缺血性星形胶质细胞溶酶体膜稳定性

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目的:实验室前期研究表明,自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)能够保护缺血性星形胶质细胞,但是其详细机制尚未明确。因此,本文旨在进一步探究抑制自噬保护缺血性星形胶质细胞的分子机制。方法:在体内,采用永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)模型,2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)染色法检测自噬抑制剂3-MA对脑梗死体积的影响;在体外,培养原代星形胶质细胞,采用糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型,以乳酸脱氢酶(LDH)测定法检测自噬抑制剂3-MA或Wortmannin(Wort)对OGD处理的星形胶质细胞损伤的影响;药理抑制(3-MA或Wort)或基因抑制(Knockdown of Atg5)抑制自噬后,Western blotting检测组织蛋白酶cathepsin B和cathepsin L的表达,细胞免疫荧光方法检测组织蛋白酶cathepsin B和cathepsin L其是否从溶酶体中释放到细胞质中;以Acridine Orange(AO)染色和Lyso-Tracker Red染色方法检测抑制自噬对溶酶体膜稳定性的影响;以Western blotting方法检测热休克蛋白70.1B(Heat shock proteins 70.1B,Hsp70.1B)在OGD过程中的时程变化,并用免疫荧光方法检测溶酶体膜Hsp70.1B的表达变化;沉默Hsp70.1B后,以AO染色方法检测其对溶酶体稳定性的影响结果:自噬抑制剂3-MA能够减少pMACO模型诱导的脑梗死体积。同样,我们观察到给予3-MA或Wort都能够显著减少缺血性星形胶质细胞乳酸脱氢酶漏出率,这说明自噬抑制剂能够直接保护星形胶质细胞,减少OGD诱导的缺血性星形胶质细胞死亡。Western blotting结果显示,药理抑制(3-MA或Wort)或基因抑制(Knockdown of Atg5)都能够显著抑制缺血性星形胶质细胞中组织蛋白酶cathepsin B和cathepsin L的激活。免疫荧光结果显示,抑制自噬能够抑制溶酶体cathepsin B和cathepsin L从溶酶体中释放到细胞质中。同时AO染色和Lyso-Tracker Red染色结果显示,抑制自噬能够增强溶酶体膜稳定性。以上结果说明抑制自噬能够增强溶酶体膜稳定性,减少溶酶体酶激活并抑制其从溶酶体中释放到细胞质中;Western blotting结果显示,星形胶质细胞在OGD过程中,Hsp70.1B表达随时间增高,在OGD 12h时达到峰值。同时免疫荧光结果显示,3-MA或Wort抑制自噬能够进一步增加缺血性星形胶质细胞溶酶体膜Hsp70.1B的表达。而且沉默Hsp70.1B后的AO染色结果显示,沉默Hsp70.1B后进一步降低溶酶体膜稳定性并能阻断自噬抑制剂增强溶酶体膜稳定性的作用。这说明抑制自噬稳定缺血性星形胶质细胞溶酶体膜可能是通过上调Hsp70.1B而发挥作用的。结论:抑制自噬能够减少缺血性脑损伤和保护缺血性星形胶质细胞;抑制自噬能够增强缺血性星形胶质细胞溶酶体膜的稳定性而保护缺血性星形胶质细胞;抑制自噬可能通过上调溶酶体膜Hsp70.1B而增强星形胶质细胞溶酶体膜稳定性。
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