亚硝酸细菌(Nitrite bacteria),是在硝化细菌中,能在好氧条件下把氨氧化成亚硝酸的土壤细菌或海洋细菌,是硝化作用第一阶段的作用菌。亚硝酸细菌广泛存在于各养殖水域,能够通过改变水环境中氨氮、亚硝酸盐浓度,改变水体环境条件,进而影响养殖生产。相比较物理、化学等方法降低养殖水环境中氨氮、亚硝酸盐含量,微生物方法以其绿色安全、无公害、无毒副作用、无污染和药物残留等特点受到越来越高的关注和应用。氨氧化细菌的氨单加氧酶(Ammonia Monooxygenase,AMO)催化氨,氧化生成羟胺是硝化反应的第一步,也是最为重要的步骤。amoA基因(Ammonia Monooxygenase A)是氨氧化细菌基因中编码氨单加氧酶(AMO)活性位点A的基因,由于不同属的氨氧化细菌的amoA基因大不相同,相同属内的不同种的amoA基因也存在有DNA水平上的明显差异,因此可以将amoA基因作为有效的特异性分子标记对待检测样品中的氨氧化细菌进行种属鉴定。故在本实验中将amoA基因作为特异性检测亚硝酸菌的目的基因。本文以海科贝特氏菌(Cobetia marina DSM 4741(T)盐单胞菌属盐单胞菌科)的amoA基因为例设计了荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)特异性引物,建立了海科贝特氏菌荧光定量PCR检测体系,并在此体系上组装了海科贝特氏菌荧光定量PCR检测试剂盒,旨在为从分子水平上建立特异、敏感、快速的亚硝酸细菌检测机制。进而使亚硝酸细菌的快速检测能够与亚硝酸细菌在其他领域的研究和实际生产应用有效的结合在一起。实验结果如下:第一,海科贝特氏菌amoA基因片段全长的PCR扩增。用DNA Purification Kit试剂盒成功提取出海科贝特氏菌总DNA,根据海科贝特氏菌的amoA基因(KGA02156)序列,通过Primer primer 5.0软件分析,设计了特异性amoA基因全长引物:CmAMOF: 5’-CTGCTGACCTCGCTGGC-3’CmAMOR: 5’-CTATTGCGTCGCCTCACG-3’采用引物CmAMOF/CmAMOR直接扩增海科贝特氏菌总DNA中的amoA基因片段,总长为1017bp。用EG101试剂盒回收纯化所得到的amoA基因DNA片段,使用PEASY-T3试剂盒将纯化的amoA基因DNA片段与T3载体连接,将连接产物导入Trans1-T3感受态细胞中培养。挑选固体培养基上蓝色斑点附近的白色单一菌落进行阳性重组子的鉴定,用PCR法鉴定其中有目的基因导入。将含有目的基因的菌液送生物公司测序,测序结果在GenBank上进行同源性比对,DNA片段与实验菌的amoA基因有较高相似性,序列一致性>98%,因此,以确定扩增所得到的DNA片段确实为海科贝特氏菌的amoA基因,从而得到标准阳性模板camoa-a。第二,建立海科贝特氏菌amoa基因荧光定量pcr体系。将海科贝特氏菌amoa基因序列导入primerprimer5.0软件中进行荧光pcr特异性引物设计得到最优引物:cyamoaf:5’-gctgctttgccgaactgat-3’cyamoar:5’-gtggcggaaatgacgtgc-3’用所设计的特异性引物cyamoaf/cyamoar对目的基因片段进行目的基因片段扩增、纯化、回收及载体的连接转化,并进行pcr鉴定和测序。测序结果在genbank上进行同源性比对,dna片段与实验菌的amoa基因有较高相似性,序列一致性>98%,确定扩增所得到的dna片段符合实验要求。用sybr®premixextaqtm(takara,japan)试剂盒对标准阳性模板进行100-106copies/μl梯度荧光定量pcr反应。得到标准曲线方程:y=-3.325x+39.433,r2=0.994,线性关系良好。计数菌体初始菌液浓度提取菌体基因组dna,按1×100-1×106进行10倍梯度稀释,进行荧光定量pcr反应。得到标准曲线方程:y=-3.313x+29.742,r2=0.992,线性关系良好。可得结论实验所设计的荧光定量pcr引物可特异性识别目的菌株,且灵敏度可达100copies/μl。第三,建立海科贝特氏菌amoa基因荧光定量pcr试剂盒,并对特异性引物用量、反应退火温度等反应条件进行优化。得到在20μlpcr反应体系中特异性引物最优用量为0.8μl,最优反应退火温度为58℃。第四,海科贝特氏菌amoa基因荧光定量pcr试剂盒各项指标检测。特异性检测:用试剂盒分别对纯菌种海科贝特氏菌菌液、亚硝酸菌a(marunomonasarenicola)、亚硝酸菌b(halomoeasventosae)、枯草芽孢杆菌a、枯草芽孢杆菌b、硝化细菌a、硝化细菌b、7种菌混合菌液、混有海科贝特氏菌菌液的海水及超纯水空白对照进行检测。其中目的纯菌种海科贝特氏菌菌液、混合菌液及混有海科贝特氏菌菌液的海水呈阳性反应,其他组为阴性。结论该试剂盒可特异性的检测出目的菌和含目的菌的混合菌液。灵敏度检测:通过普通pcr和荧光定量pcr分别对阳性模板和菌液进行梯度检测,检测结果表明荧光定量pcr的检测灵敏度远高于普通pcr。重复性检测:用标准阳性模板和菌体基因组dna模板进行6孔重复性检测,各独立进行5次。经数据处理得到荧光定量pcr变异系数小于2%,说明该荧光定量试剂盒的重复性良好。稳定性检测:将保存于-20°c冰箱里的试剂盒中的试剂反复冻融1、10、20、30、40、50次后对标准阳性模板进行pcr扩增,经数据处理得到f=0.307>0.05该试剂盒具有较高稳定性。确定保存期:每个月取出保存于-20°C的试剂进行荧光定量PCR检测,连续检测7个月,每次检测均得到阳性结果,表明本试验中建立的亚硝化细菌amoA基因荧光定量PCR检测试剂盒稳定性至少在7个月以上。